Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам
Summary
Обнаружение взаимодействий патогенов-хозяев и бактерий на основе фенотипической приверженности с использованием высокопроизводительной флуоресцентной маркировки изображений наряду с автоматизированными методами статистического анализа позволяет быстро оценить потенциальные бактериальные взаимодействия с клетками-хозяевами.
Abstract
Идентификация новых бактериальных патогенов имеет решающее значение для здоровья и безопасности человека. Бактериальная приверженность клеткам-хозяевам является важным шагом при бактериальных инфекциях и представляет собой признак потенциальной угрозы. Поэтому изучение приверженности бактерий к клеткам-хозяевам может быть использовано в качестве компонента оценки бактериальной угрозы. Стандартный метод перечисления бактериальной приверженности клеткам-хозяевам заключается в совместной инкубации бактерий с клетками-хозяевами, сборе адгезивных бактерий, нанесении собранных клеток на твердые среды, а затем подсчете результирующих колониеобразующих единиц (КОЕ). Альтернативно, бактериальная приверженность к клеткам-хозяевам может быть оценена с использованием подходов, основанных на иммунофлуоресцентной микроскопии. Однако традиционные стратегии реализации этих подходов отнимают много времени и неэффективны. Здесь описан недавно разработанный автоматизированный метод визуализации на основе флуоресцентной микроскопии. В сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом метод позволяет быстро количественно оценить бактерии, которые прилипают к клеткам-хозяевам. Два вида бактерий, Gram-отрицательный Pseudomonas aeruginosa и Gram-positive Listeria monocytogenes и соответствующие отрицательные контрольные группы, были протестированы для демонстрации протокола. Результаты показывают, что этот подход быстро и точно перечисляет адгезивные бактерии и значительно снижает экспериментальные нагрузки и сроки.
Introduction
Бактериальная адгезия – это процесс, посредством которого бактерии прикрепляются к другим клеткам или поверхностям. Успешное установление инфекции бактериальными возбудителями требует адгезии к клеткам-хозяевам, колонизации тканей, а в некоторых случаях и инвазии клеток-хозяев1,2,3. Возникающие инфекционные заболевания представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению, о чем свидетельствует недавняя пандемияCOVID-19 4,5,6. Важно отметить, что новые или возникающие патогены не могут быть легко распознаны с использованием геномных подходов, особенно в тех случаях, когда патоген был спроектирован так, чтобы избежать обнаружения или не содержит геномных сигнатур, которые идентифицируют его как патогенный. Поэтому идентификация потенциальных патогенов с использованием методов, которые непосредственно оценивают признаки патогенности, такие как бактериальная приверженность клеткам-хозяевам, может играть решающую роль в идентификации патогенов.
Бактериальная адгезия к клеткам-хозяевам использовалась для оценки механизмов бактериального патогенеза на протяжениидесятилетий 1,7. Микроскопическая визуализация8,9 и перечисление бактериальной колониеобразующей единицы (КОЕ)10,11,12,13 путем постинфекционного покрытия являются двумя хорошо разработанными лабораторными методами тестирования микробной адгезии и/или инфицирования клеток-хозяев14. Учитывая размер бактериальных клеток в микрометровом масштабе, перечисление адгезивных бактериальных клеток обычно требует использования передовых методов микроскопии с высоким увеличением, а также подходов к визуализации с высоким разрешением, включая электронную микроскопию, расширительную микроскопию (ExM)15,16и трехмерную визуализацию17 . Альтернативно, перечисление бактерий, связанных или интернализованных внутри клеток-хозяев, может быть выполнено путем покрытия серии разбавления собранных бактерий на твердом агаре и подсчета результирующих КОЕ10,12,13. Этот метод трудоемкий и включает в себя множество ручных шагов, что создает трудности в создании стандартизированной или автоматизированной процедуры, необходимой для высокопроизводительных анализов18,19. Таким образом, разработка новых методов оценки прикрепления клеток-хозяев позволит устранить текущие ограничения в этой области.
Здесь описан один из таких методов, который использует автоматизированную высокопроизводительную микроскопию в сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом. Чтобы продемонстрировать подход, были проведены эксперименты с несколькими бактериальными патогенами, в том числе Pseudomonas aeruginosa,оппортунистическим грамотрицательным бактериальным патогеном человека, животных и растений14,20,который часто обнаруживается для колонизации дыхательных путей пациентов с нарушенными защитными функциями хозяина. Этот подход оптимизировал процесс микроскопической визуализации, описанный в предыдущих исследованиях14,20. Обнаружение изображений было упрощено флуоресцентно-мечеными клетками-хозяевами и бактериями для быстрого отслеживания их близости, что значительно снизило рабочую нагрузку микроскопии для получения изображений с высоким разрешением для различения бактерий. Кроме того, автоматизированный статистический анализ изображений при подсчете клеток-хозяев и бактерий заменил ручной эксперимент по бактериальному покрытию КОЕ для оценки соотношения количества адгезивных бактерий на клетку-хозяина. Чтобы подтвердить совместимость этого метода, также были протестированы множественные бактериальные штаммы и типы клеток-хозяев, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Klebsiella pneumoniae, а также эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVECs), и результаты подтверждают разнообразие и эффективность метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описывает автоматизированный подход к перечислению бактериальной привязанности к клеткам-хозяевам. Описанный подход имеет ряд привлекательных преимуществ перед обычными методами. Во-первых, этот подход позволяет точно количественно оценить количество клеток микробного па…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны доктору Кайте Злотковски из Biotek Inc. за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством обороны по контракту W911NF1920013 с PdF, Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA) и Министерством внутренних дел по контракту No 140D6319C0029 с PdF. Содержание информации не обязательно отражает позицию или политику правительства, и не следует делать никаких выводов об официальном одобрении.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
