Summary
光学活化全氟化碳纳米液滴在血管系统以外的成像应用中显示出前景。本文将演示如何合成这些颗粒，交联聚丙烯酰胺模型，并在声学上调制液滴以增强其信号。
Abstract
微泡是超声中最常用的成像造影剂。然而，由于它们的大小，它们仅限于血管室。这些微气泡可以冷凝或配制成全氟化碳纳米液滴（PFCnD），其小到足以外渗，然后在目标位点以声学方式触发。这些纳米颗粒可以通过包括诸如近红外有机染料或纳米颗粒（例如硫化铜纳米颗粒或金纳米颗粒/纳米棒）的光吸收剂来进一步增强。光学标记的PFCnD可以通过激光照射在称为光滴汽化（ODV）的过程中汽化。这种活化过程允许使用高沸点全氟化碳核心，这些核心在诊断成像的最大机械指数阈值下不能在声学上汽化。较高的沸点核心导致液滴在汽化后重新冷凝，导致“闪烁”PFCnD在蒸发后短暂产生对比度，然后凝结回纳米液滴形式。该过程可以重复以按需产生对比度，从而允许通过光学和声学调制进行无背景成像、多路复用、超分辨率和对比度增强。本文将演示如何利用探针超声合成光学触发的脂壳PFCnD，创建聚丙烯酰胺模型来表征纳米液滴，并在ODV后对PFCnD进行声学调制以提高对比度。
Introduction
微泡是最普遍的超声造影剂，因为与软组织相比，微泡具有生物相容性和出色的回声性。这使它们成为可视化血流、器官描绘和其他应用的宝贵工具1。然而，它们的尺寸（1-10μm）使它们在基于共振频率的成像中非常出色，因此将其应用限制在脉管系统2上。
这种限制导致了PFCnD的发展，PFCnD是由包裹在液体全氟化碳核心周围的表面活性剂组成的纳米乳液。这些纳米颗粒可以以小至200nm的尺寸合成，旨在利用肿瘤脉管系统中发现的“泄漏”脉管系统或孔隙和开窗。虽然这些破坏是肿瘤依赖性的，但这种渗透性允许纳米颗粒从~200nm-1.2μm外渗，具体取决于肿瘤3，4。在它们的初始形式中，这些颗粒几乎不产生超声波对比度。在汽化时 - 通过声学或光学诱导 - 核心相从液体变为气体，导致直径增加两倍半到五倍5，6，7并产生光声和超声波对比。虽然声学汽化是最常见的激活方法，但这种方法会产生声学伪影，从而限制汽化成像。此外，大多数全氟化碳需要机械指数超过安全阈值的聚焦超声才能蒸发8。这导致了低沸点PFCnD的发展，它可以通过将微气泡冷凝成纳米液滴来合成9。然而，这些液滴更易挥发，并且会自发汽化10。
另一方面，光滴汽化（ODV）需要添加光学触发器，例如纳米颗粒11，12，13或染料6，14，15，并且可以使用ANSI安全限值11内的注量蒸发更高沸点的全氟化碳。用更高沸点核心合成的PFCnD更稳定，汽化后会重新凝结，从而实现无背景成像16、多路复用17和超分辨率18。这些技术的主要局限性之一是高沸点PFCnD在汽化后仅在短时间内产生回波，在毫秒19的尺度上，并且相对较暗。虽然这个问题可以通过反复汽化和平均来缓解，但液滴信号的检测和分离仍然是一个挑战。
从脉冲反转中汲取灵感，可以通过修改超声成像脉冲19的相位来增强持续时间和对比度。通过以稀疏相（n脉冲）启动超声成像脉冲，汽化PFCnD的持续时间和对比度都会增加。相反，以压缩期（p脉冲）启动超声成像脉冲会导致对比度降低和持续时间缩短。本文将介绍如何合成光学触发的全氟化碳纳米液滴，即成像中常用的聚丙烯酰胺模型，并通过声学调制演示对比度增强和延长信号寿命。
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Protocol
1. 全氟化碳纳米液滴制剂
- 用氯仿冲洗出 10 mL 圆底烧瓶，然后反复吸出整个注射器体积并排出总共 3 次，用氯仿冲洗 10 μL 和 1 mL 气密玻璃注射器。
注意：氯仿是挥发性的，如果吸入可能有毒。所有使用该溶剂的工作都应在通风橱中进行。 - 使用注射器，将 200 μL DSPE-mPEG2000 （25 mg/mL）、6.3 μL 1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC，25 mg/mL）和 1 mL IR 1048（1 mg/mL 氯仿溶液）加入圆底烧瓶中。请记住清理脂质/染料之间的注射器，以防止污染库存。
注意：红外染料对光敏感，应在昏暗的条件下工作，或者烧瓶应用铝箔覆盖。 - 使用旋转蒸发器除去溶剂。确保将真空缓慢调节到 332 mbar，以防止碰撞。5分钟后，将压力降低至42毫巴以除去可能已进入溶液的任何水。
注意：脂质饼可以在4°C下在覆盖有封口膜的圆底烧瓶中储存过夜。 - 将脂质饼悬浮在 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在室温下超声处理或涡旋 5 分钟或直到所有脂质饼悬浮并溶解在溶液中。超声处理2分钟以使溶液均质化。
- 将溶液转移到 7 mL 玻璃小瓶中，并将小瓶放入装满冰的玻璃培养皿中，让溶液冷却 5 分钟，然后使用气密玻璃注射器加入 50 μL 全氟己烷。请记住在将注射器分配到小瓶中之前用全氟己烷冲洗注射器。
- 将装有脂质和冰浴的玻璃小瓶放入探头超声仪外壳中，并将探头尖端浸入微型探头下方。确保超声仪探头的侧面不接触玻璃小瓶的边缘。
- 探头使用以下设置对混合物进行超声处理：振幅 1，处理时间：20 秒，脉冲开启：1 秒，脉冲关闭：5 秒。然后以以下设置进行超声处理：振幅：50，处理时间：5秒，脉冲开启：1秒，脉冲关闭：10秒。
- 将纳米液滴溶液转移到1.5mL离心管中，并以300× g 离心3分钟，以从较小的液滴中分离出较大的液滴（>1μm）。
- 弃去沉淀并将上清液转移到另一个 1.5 mL 离心管中。通过以3000× g 离心5分钟洗涤上清液以沉淀溶液中的所有液滴。通过上下移液沉淀将 PFCnD 重悬于 1 mL PBS 中，然后在浴超声仪中超声处理 1 分钟。
- 使用动态光散射 （DLS） 测量液滴的大小。将原液PFCnD稀释100倍（10μLPFCnD原液在990μLPBS中）并在测量前对浴进行超声处理以分散PFCnD。代表性结果如图 1所示。
- 使用纳米颗粒示踪分析仪确定PFCnD的浓度（参见 材料表）。将PFCnD稀释100-1000倍，以确保准确测量浓度。该方案通常产生浓度约为 1010 个颗粒/mL 的液滴。
- 在 50 mL 离心管中制备 10 mL 超声偶联凝胶，加入 1% （v/v） 或 100 μL PFCnD，制成 ~108 个颗粒/mL 的溶液。涡旋溶液进行混合。将混合物以4000× g 离心3分钟以除去气泡。
2.聚丙烯酰胺幻影制备
- 通过在 500 mL 真空烧瓶中填充 400 mL 去离子水对水进行脱气，用橡胶软木塞密封，然后将烧瓶连接到真空管路。打开真空管路，将烧瓶底部浸入浴超声仪中。超声处理5分钟或直到看不到气泡形成。
- 通过将 500 mg 溶解在 5 mL 脱气水中来制备 10% 过硫酸铵 （APS） 溶液。如果过硫酸铵没有完全溶解，轻轻旋转溶液。
- 在搅拌板上带有搅拌棒的 400 mL 烧杯中，加入 150 mL 脱气水和 50 mL 40% （w/v） 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，形成 200 mL 10% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。以 200 rpm 的速度搅拌混合物，以便在不引入气泡的情况下进行适当的混合。
注意：丙烯酰胺是一种致癌物质，所有工作都应戴手套在通风橱中进行，尤其是在使用粉末形式的丙烯酰胺时。 - 称取400mg二氧化硅，加入步骤2.3中的10%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液中，形成0.2%（w / v）的二氧化硅和丙烯酰胺溶液。
注意：吸入二氧化硅可能是一种致癌物质。包括称重在内的所有工作都应在通风橱中进行。 - 通过从塑料转移移液器上切断尖端并用实验室胶带将其固定在模具中，准备一个带有圆柱形内含物的 58 mm x 58 mm x 78 mm 方形模具。参见 图2。
- 向烧杯中加入 2 mL 的 10 % APS 溶液，使终浓度为 0.1% APS，并向幻影溶液中加入 250 μL 四甲基乙二胺 （TEMED）。让溶液短暂搅拌（不到一分钟）。
- 快速将溶液倒入模具中，同时注意不要将气泡引入溶液中。溶液应在10分钟内聚合。通过将实验室刮刀的平端绕模具边缘并倒置模具来去除幻影。
注意：这些幻影可以多次重复使用，应浸入水中并储存在 4°C。
3. 全氟化碳纳米液滴成像
- 按照制造商的说明打开并预热脉冲激光系统~20分钟。确保光纤束正确连接到激光输出，并且两个支腿正确放置在光纤束支架内。
- 打开超声成像系统，将阵列成像换能器（L11-4v）连接到系统，并将换能器固定在支架内，使其成像平面与激光横截面对齐。
- 将激光系统的脉冲重复频率设置为10Hz，并在光纤束的末端放置一个功率计以测量能量。调谐 q 开关延迟，直到估计的通量为 70 mJ/cm2。
注意：发射激光时必须佩戴适当的眼镜，激光幕必须封闭空间。 - 使用 1 mL 塑料滑头注射器用超声凝胶/PFCnD 混合物回填聚丙烯酰胺模型中的一个通道。用超声凝胶自由覆盖通道顶部，并用 1 mL 塑料滑头注射器去除任何气泡。将聚丙烯酰胺模型放在换能器和光纤束下方，如图 3所示。
- 使用基于软件20 的组合激光超声和弹性（CLUE）成像平台对PFCnD进行与光学激活同步的成像。更改 参数结构中 用于成像的常规用户定义参数：将开始/结束深度设置为0/40mm，中心频率设置为6.9MHz，传感器名称设置为“L11-4v”。
- 定义新的 RunCase 并设计用于重复光学激活/重聚和 PFHnD 的 US 成像的模块序列。这是通过列出预定义的模块来完成的，例如超快成像（mUF），外部激光器（mExtLaser）和空闲（mIdle）。
- 重复序列集 mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF 两次，以获取n脉冲和p脉冲成像数据。
注意：通过将 ExtLaser.Enable 设置为 0，将每个序列中的第一个 mExtLaser 模块设置为假激光器，并包括“mIdle”，以最大限度地减少激光激活后背景美国图像和 n/p 脉冲美国图像之间的时间。
- 重复序列集 mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF 两次，以获取n脉冲和p脉冲成像数据。
- 为放置在当前运行案例的模块序列中的每个模块设置模块参数。通过与模块序列中的顺序对应的索引访问每个模块参数。模块将使用用户在此处设置的模块参数执行预定义的操作。
- 将外部激光模块中的 ExtLaser.QSdelay 设置为在步骤 3.3 中调整的激光 Q 开关延迟值（以微秒为单位）。该模块等待激光系统的闪光灯触发，并在 QSdelay中指定的延迟后产生Q开关触发。
- 在超快成像模块中，将 Resource.numFrame 设置为 100，将 SeqControl.PRI 设置为 200 （μs），并将 TW.polarity 设置为 1（对于 P 脉冲，将 -1 设置为 -1（相应的脉冲形状见 图 4 ）。该模块将传输超快的0度平面波，脉冲类型以 TW.极性指定。
- 获取 38.8 mm 宽的全孔径成像窗口，用于 Resource.numFrame 中的帧数、 SeqControl.PRI 的脉冲重复间隔，然后保存数据以供离线处理。
- 将空闲模块中的 SeqControl.lastPRI_Module 设置为激光脉冲之间的时间长度（100 ms）减去Q开关延迟、成像数据采集时间（20 ms）和信号传播的20 μs裕量。该模块使系统在 SeqControl.lastPRI_Module 时间内保持“无操作”状态，以填补成像数据采集结束和下一次激光脉冲激发之间的时间间隔。
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Representative Results
PFCnDs的成功配制和离心分离应产生直径约为200-300nm的液滴（图1A）。分离不当的液滴可能在1μm附近显示小峰。这些溶液可以进一步进行浴超声处理，以分解较大的液滴。由于在称为奥斯特瓦尔德成熟21，22的过程中聚结和/或扩散，液滴的大小将随着时间的推移而增加（图1B）。
通过操纵成像脉冲对液滴进行声学调制，提高了汽化PFCnD的对比度。这在通过减去波束成形图像的相邻帧重建的PFCnD图像中得到了证明，因此只有从汽化PFCnD返回的信号是可见的，并且抑制了静止的背景信号。对比度通过圆形夹杂区域的平均信号与平均背景信号与平均背景信号之间的差异之比来量化。背景信号由来自背景的两个矩形ROI的信号定义，这两个ROI与夹杂物的深度和等效区域相同。N脉冲与内含物的对比度大约是P脉冲的3.2倍（即改善220%）（图5）。
反转成像脉冲还延长了PFCnD汽化信号的寿命。这是通过阈值化超过背景信号的圆形内含物区域中的像素来量化的。夹杂物中高于阈值的像素百分比定义为高回声区域 （%）。为了检查PFCnD随时间变化的高回声行为，计算每帧的高回声面积，并通过第一帧的高回声面积进行归一化，然后拟合到指数衰减模型。该函数用于确定特征衰减时间，定义为PFCnD激活后高回声区域衰减到初始面积的10%所需的时间跨度（图6a）。归一化高回声区的特征衰减时间在N脉冲成像中比P脉冲长3.5倍。每个N脉冲和P脉冲成像的代表性B模差分图像帧时间如图 6b所示。
图 1：PFCnD 的 DLS 尺寸测量和稳定性。 （A）合成后三次液滴测量平均值的液滴尺寸强度分布（平均PDI：0.132±0.016;平均Z平均值：259.3±0.7nm）。（B）合成后24小时进行的三次测量平均液滴的尺寸强度分布（平均PDI：0.252±0.061;平均Z平均值：322.5±4.5nm）。请点击此处查看此图的大图。
图2：聚丙烯酰胺模具的图像和示意图 。 （A）由实验室胶带和塑料容器制成的模具的图像。（B）从模具中取出聚丙烯酰胺模型后的测量示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：激光脉冲传输和超声成像的示意图 。 （A）对组件的组件进行标记，并说明激光束/超声成像平面相对于夹杂物位置的对齐。（B） 显示实际设置的图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：模拟超声成像脉冲。 波形由超声成像系统软件模拟，采样频率为250 MHz。P脉冲和N脉冲的波形以相同的中心频率和脉冲宽度产生，但具有180°的相位差。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：对比度测量。 N脉冲和P脉冲夹杂区域的平均对比度值，误差条表示标准偏差（n=3）。 请点击此处查看此图的大图。
图6：高回声区域和代表性差分B模法师的特征衰减曲线 。 （A） PFCnD 激活随时间推移在同一横截面上对 N 脉冲和 P 脉冲成像诱导的归一化高回声区域。虚线表示初始高回声区域的 10%。拟合图与虚线相交的时间表示特征衰减时间。（B） 图像显示以内含物为中心的裁剪 ROI 窗口，以 dB 刻度绘制，动态范围为 35。上行显示由P脉冲成像的再凝聚行为，下行显示N脉冲。黄色虚线表示包含区域。 请点击此处查看此图的大图。
| 幻影总体积（毫升） | 50 | 100 | 250 | 500 |
| 去离子水（毫升） | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| 40% PA 溶液（毫升） | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| 二氧化硅（毫克） | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 10% APS 溶液 （μL） | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| 泰米德 （微升） | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
表1：基于模具体积的聚丙烯酰胺幻影交联的试剂和用量摘要。 此表提供了所用试剂的简明值摘要，以及基于几种常见模具体积的用量。
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Discussion
探针超声处理是一种相对简单易学的PFCnD制备方法。有几个步骤必须小心。处理氯仿时，必须使用外置活塞式移液器或玻璃注射器，因为它具有挥发性，并且会从标准空气置换式移液器中“泄漏”。此外，如果使用正置换，请确保使用适当的吸头，因为氯仿会溶解大多数塑料吸头，这会将污染物引入溶液中。对于全氟己烷，还建议使用外置活塞式移液器或玻璃注射器，因为它既易挥发又比水密度大。通常，可以通过在空气置换式移液器中进行预润湿和使用秤分别调整移液器上设置的体积来减少挥发性和高密度的个别影响。但是，对于具有这两种特性的全氟己烷，挥发性将难以获得准确的重量测量值，因此外置活塞式移液器/玻璃注射器成为最可行的选择。
在对溶液进行超声处理之前，重要的是将脂质和全氟化碳溶液在冰浴中孵育，使其冷却以防止在超声处理过程中使全氟化碳沸腾。此步骤对于低沸点全氟化碳（如全氟戊烷）尤其重要。此外，在探测溶液超声处理时必须小心。超声探头尖端应浸没，但不应与玻璃小瓶的底部或侧面接触，因为它可能会损坏尖端并粉碎小瓶，将脂质溶液排入冰浴中。
PFCnD制造方案可以通过一些次要方式进行调整。如果在步骤1.3中没有旋转蒸发器，则可以用稳定的氮气流干燥溶液或将其置于真空室中过夜以形成脂饼。关于脂质，该配方采用 DSPE-PEG：DSPC 的 9：1 比例，而 DSPE-PEG：DSPC 的标准比例为 1：9，因为它会产生更小、尺寸更稳定的液滴23。该配方可以通过用具有所需部分（例如生物素、硫醇、胺等）的官能化 DSPE-PEG 替换一小部分 （~2 mol %） 来调整以允许表面偶联。
一般来说，探针超声仪是市售的，使用相对简单，可以很容易地适应其他更高沸点的全氟化碳和表面活性剂配方，但它不能用于制造具有全氟化碳芯的液滴，这些液滴在室温下是气态的，没有明显的修改。其中一种修改是利用探针超声处理来产生微气泡，然后施加压力并降低温度以将微气泡冷凝成液滴24。虽然这种方法是产生声学可蒸发液滴的聪明方法，但很难在微气泡中封装足够的染料以确保冷凝后的ODV。另一种方法是将染料（例如Cy7.5）与脂质偶联并形成微气泡，这些微气泡可以凝结成具有ODV功能的低沸点PFCnDs25。
探针超声处理还可以在相对较短的时间内产生高浓度的纳米液滴（~1010 液滴/mL）。然而，这种技术导致大尺寸分布，这将减少外渗的纳米液滴的数量。虽然这可以通过离心过滤或注射器过滤器来改善以去除较大的液滴，但与使用微流体合成或通过挤出过滤的液滴相比，所得的PFCnD将表现出更大的多分散性26。超声探头的另一个缺点是超声探头尖端在超声处理过程中不可避免地会因气蚀而出现凹陷，需要定期更换。
产生液滴的另一种方法利用微流体装置，可用于将液滴定制为具有低多分散指数（PDI）的特定尺寸。然而，这些装置以相对较慢的速度（~104-10 6 液滴/秒）产生液滴26，并且虽然已经有几项发展，例如步进乳化27，流动聚焦装置中的尖端流28，29，以及利用交错人字形微混合器的茴香酒效应30 - 产生纳米级液滴仍然具有挑战性。此外，这种技术不是商业上可用的，这些设备的制造需要专业知识。
其他市售方法包括挤出和均质。挤出利用膜使液滴通过，从而产生纳米尺寸的液滴，与超声处理相比，其尺寸范围更窄。然而，这种方法严重依赖于配方，并且难以将染料或治疗货物掺入液滴26中。高压均质利用市售均质机，利用高压和剪切应力以可扩展的方式产生单分散的纳米级脂质颗粒31，32，33。该方法已被调整为产生具有高沸点和低沸点全氟化碳32，34的液滴。关于液滴配制方法和样品方案的更实质性综述可以在以下综述中找到26。
模型是表征体 外纳米液滴性能的宝贵工具。在该协议中，使用基于聚丙烯酰胺的二氧化硅模型。聚丙烯酰胺模型最常见的问题与聚合缓慢或无聚合有关。缓慢聚合虽然问题较少，但会导致嵌入散射的异质分布。这个问题最常见的罪魁祸首是使用过硫酸铵的旧溶液，这些溶液减少了引发交联的自由基的产生。这可以通过使溶液新鲜或不使用超过一周的准备好的溶液来轻松解决。另一种可能性是TEMED的降解 - 这将在黄色沉淀物的形成中很明显。另一个常见问题是聚合模型中存在气泡。对水进行适当的脱气和小心处理以避免过度的表面搅拌应该可以缓解这个问题。另一种策略是在步骤 2.5 之后对整个溶液进行脱气。但是，由于丙烯酰胺的存在，这应该在通风橱中进行。
这些模型也非常适合对受限液滴的行为进行成像，以研究单个液滴的行为;这可以通过在步骤 2.4 中将 PFCnD 添加到模型中来完成。此外，由于交联是由于化学反应引起的，因此与基于明胶等高临界溶液温度的物理交联相比，产生的热量相对较少。这降低了嵌入液滴自发汽化的可能性。
虽然合成模型的方法多种多样，但聚丙烯酰胺产生的模型相对耐用且不可降解，具有低声衰减35 和光吸收系数36。通过调节最终聚丙烯酰胺溶液的浓度并通过在幻影中加入颗粒（如二氧化硅、玻璃珠或二氧化钛36），可以调整这些特性以更紧密地模拟人体组织的声学和光学特性。此外，可以通过修改聚合物含量的百分比（即丙烯酰胺和双（丙烯酰胺）的百分比）和交联剂的百分比（即双（丙烯酰胺）占总聚合物含量的百分比）来调整模型的机械性能37。替代幻影包括但不限于琼脂38、明胶39、聚乙烯醇（PVA）40等。
成功对活化的PFCnD分布和高回声动力学进行成像的关键步骤如下。1）同步激光系统（激活源）和超声成像系统。2） 将激光横截面与感兴趣的目标区域和超声成像平面对齐。3）调整适合PFCnD成像的超声成像参数（即帧率、脉冲波形等）。
与声学激活相比，PFCnD的光学激活具有明显的优势，它可以避免声学干扰，从而大大降低超声图像的质量，同时及时观察其再凝聚阶段。然而，在空间和时间上将激光系统与超声成像系统集成和对齐具有挑战性。使用3D打印支架可以实现可重复和受控的光传输。还可以通过将金属棒插入聚丙烯酰胺模型中的夹杂物来排除光传输问题，因为金属棒应产生光声对比度以指示光传输。时间同步是通过构建先前开发的平台20来实现的，该平台允许激光和成像系统的同步，同时保持Verasonics成像系统具有用户友好界面的完全可编程性。此外，该程序还提供实时常规B模式成像和光声成像，以帮助排除故障和定位PFCnD分布的感兴趣区域。但是，这种设置需要外部纳秒脉冲激光器。目前，据我们所知，有一些商业系统集成了激光超声成像系统，可以允许PFCnD成像，例如Visualsonics（Vevo LAZR，Vevo LAZR-X，Vevo 3100，Vevo F2），Endera Nexus 128和iTheraMedical（insight 64，inVision 128，inVision 256-TF和inVision 512-echo）。
PFCnD汽化-再冷凝行为的超快超声成像主要存在灵敏度低的问题。虽然最常见的图像灵敏度增强解决方案包括多帧复合，但这些技术受到其降低帧速率的固有特性的限制，因为PFCnD成像非常容易受到运动伪影的影响，因为它包括时差过程。我们协议中的脉冲极性调制通过利用汽化PFCnD的声学动力学来有效地解决PFCnD成像中的这个问题，以获得更具可区分性和更长的图像，同时完全不影响时间分辨率。
虽然ODV允许液滴具有独特的功能，例如重复汽化和光声对比，但与超声波相比，激活方法的深度穿透有限。由于光穿透有限，这限制了应用主要是浅表程序，例如替代前哨淋巴结活检41。这种限制可以通过基于导管的光输送系统绕过，从而允许在组织深处激活。由于对比度是声学的，因此汽化将能够在与ADV相当的深度上成像。另一种活化技术可以是磁滴汽化，其中磁性造影剂如氧化铁纳米颗粒被封装在液滴42内。这将允许在任何深度蒸发。
将来，我们的协议同时成像和调制PFCnD的高回声响应的能力可用于需要监测和操作PFCnD的多种应用。例如，更长的可检测时间可以通过提供更多的帧数来改善超分辨率成像的图像质量。此外，更精确地控制PFCnD有可能提高气泡介导疗法（如BBB开口和药物递送）的效率和安全性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了乳腺癌研究基金会BCRF-20-043的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
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