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Bioengineering

Formulación y modulación acústica de nanogotas de perfluorocarbono vaporizadas ópticamente

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

Las nanogotas de perfluorocarbono activadas ópticamente son prometedoras en aplicaciones de imágenes fuera del sistema vascular. Este artículo demostrará cómo sintetizar estas partículas, fantasmas de poliacrilamida de entrecruzamiento y modular las gotas acústicamente para mejorar su señal.

Abstract

Las microburbujas son el agente de contraste de imágenes más utilizado en ultrasonido. Sin embargo, debido a su tamaño, se limitan a compartimentos vasculares. Estas microburbujas pueden condensarse o formularse como nanogotas de perfluorocarbono (PFCnD) que son lo suficientemente pequeñas como para extravasarse y luego activarse acústicamente en el sitio objetivo. Estas nanopartículas pueden mejorarse aún más mediante la inclusión de un absorbente óptico, como un tinte orgánico infrarrojo cercano o nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas de sulfuro de cobre o nanopartículas / nanovarillas de oro). Los PFCnD marcados ópticamente se pueden vaporizar a través de la irradiación láser en un proceso conocido como vaporización óptica de gotas (ODV). Este proceso de activación permite el uso de núcleos de perfluorocarbono de alto punto de ebullición, que no pueden vaporizarse acústicamente por debajo del umbral máximo de índice mecánico para el diagnóstico por imágenes. Los núcleos de punto de ebullición más altos dan como resultado gotas que se recondensarán después de la vaporización, lo que resulta en PFCnD "parpadeantes" que producen contraste brevemente después de la vaporización antes de condensarse nuevamente en forma de nanogotas. Este proceso se puede repetir para producir contraste bajo demanda, lo que permite la creación de imágenes sin fondo, multiplexación, superresolución y mejora del contraste a través de la modulación óptica y acústica. Este artículo demostrará cómo sintetizar PFCnD de cáscara lipídica ópticamente activables utilizando sonicación de sonda, crear fantasmas de poliacrilamida para caracterizar las nanogotas y modular acústicamente los PFCnD después de ODV para mejorar el contraste.

Introduction

Las microburbujas son el agente de contraste de ultrasonido más ubicuo debido a su biocompatibilidad y excelente ecogenicidad en comparación con los tejidos blandos. Esto los convierte en herramientas valiosas para visualizar el flujo sanguíneo, la delineación de órganos y otras aplicaciones1. Sin embargo, su tamaño (1-10 μm), que los hace excepcionales para la obtención de imágenes en función de su frecuencia de resonancia, restringe sus aplicaciones a la vasculatura2.

Esta limitación ha llevado al desarrollo de PFCnDs, que son nanoemulsiones compuestas de un surfactante encerrado alrededor de un núcleo de perfluorocarbono líquido. Estas nanopartículas se pueden sintetizar en tamaños tan pequeños como 200 nm y están diseñadas para aprovechar la vasculatura o los poros "permeables" y las fenestraciones abiertas que se encuentran en la vasculatura tumoral. Si bien estas interrupciones dependen del tumor, esta permeabilidad permite la extravasación de nanopartículas de ~ 200 nm - 1.2 μm dependiendo del tumor 3,4. En su forma inicial, estas partículas producen poco o ningún contraste de ultrasonido. Tras la vaporización, inducida acústica u ópticamente, la fase central cambia de líquido a gas, induciendo un aumento de dos veces y media a cinco veces en el diámetro 5,6,7 y generando contraste fotoacústico y de ultrasonido. Si bien la vaporización acústica es el método de activación más común, este enfoque crea artefactos acústicos que limitan la imagen de la vaporización. Además, la mayoría de los perfluorocarbonos requieren ultrasonido focalizado con un índice mecánico más allá del umbral de seguridad para vaporizar8. Esto ha llevado al desarrollo de PFCnD de menor punto de ebullición, que pueden sintetizarse condensando microburbujas en nanogotas9. Sin embargo, estas gotitas son más volátiles y están sujetas a vaporización espontánea10.

La vaporización óptica de gotas (ODV), por otro lado, requiere la adición de un disparador óptico como nanopartículas 11,12,13 o colorante 6,14,15 y puede vaporizar perfluorocarbonos de mayor punto de ebullición utilizando fluencias dentro del límite de seguridad ANSI 11. Los PFCnD sintetizados con núcleos de punto de ebullición más altos son más estables y se recondensarán después de la vaporización, lo que permite imágenes libres de fondo16, multiplexación 17 y superresolución18. Una de las principales limitaciones de estas técnicas es el hecho de que los PFCnD de alto punto de ebullición son ecogénicos después de la vaporización durante un corto período de tiempo, en la escala de milisegundos19, y son relativamente débiles. Si bien este problema puede mitigarse mediante vaporizaciones repetidas y promedios, la detección y separación de la señal de gotitas sigue siendo un desafío.

Inspirándose en la inversión del pulso, la duración y el contraste pueden mejorarse modificando la fase del pulso de imagen de ultrasonido19. Al iniciar el pulso de imagen de ultrasonido con una fase de rarefacción (n-pulso), tanto la duración como el contraste de los PFCnD vaporizados aumentan. Por el contrario, el inicio del pulso de imágenes de ultrasonido con una fase de compresión (pulso p), da como resultado un contraste reducido y una duración más corta. Este artículo describirá cómo sintetizar nanogotas de perfluorocarbono activables ópticamente, fantasmas de poliacrilamida comúnmente utilizados en imágenes, y demostrar la mejora del contraste y la longevidad mejorada de la señal a través de la modulación acústica.

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Protocol

1. Formulación de nanogotas de perfluorocarbono

  1. Enjuagar un matraz de fondo redondo de 10 ml con cloroformo y lavar una jeringa de vidrio hermético al gas de 10 μL y 1 ml con cloroformo aspirando repetidamente el volumen completo de la jeringa y expulsándolo un total de tres veces.
    PRECAUCIÓN: El cloroformo es volátil y puede ser tóxico si se inhala. Todo el trabajo con este disolvente debe realizarse en una campana extractora.
  2. Con ayuda de las jeringas, añadir 200 μL de DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, 25 mg/ml) y 1 ml de IR 1048 (1 mg/ml en cloroformo) en el matraz de fondo redondo. Recuerde limpiar las jeringas entre lípidos/tinte para evitar la contaminación del caldo.
    NOTA: Los tintes infrarrojos son sensibles a la luz, y el trabajo debe realizarse en condiciones de poca luz o los frascos deben cubrirse con papel de aluminio.
  3. Retire el disolvente utilizando un evaporador rotativo. Asegúrese de que el vacío se ajuste lentamente a 332 mbar para evitar golpes. Después de 5 minutos, reduzca la presión a 42 mbar para eliminar cualquier agua que pueda haber entrado en la solución.
    NOTA: La torta lipídica puede almacenarse durante la noche en un matraz de fondo redondo cubierto con parafilm a 4 °C.
  4. Suspenda la torta lipídica en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y sonicate o vórtice a temperatura ambiente durante 5 minutos o hasta que toda la torta lipídica se haya suspendido y disuelto en la solución. Sonicar durante 2 minutos adicionales para homogeneizar la solución.
  5. Transfiera la solución a un vial de vidrio de 7 ml y colóquelo en un plato de vidrio lleno de hielo para permitir que la solución se enfríe durante 5 minutos antes de agregar 50 μL de perfluorohexano con una jeringa de vidrio hermética al gas. Recuerde enjuagar la jeringa con perfluorohexano antes de dispensarla en el vial.
  6. Coloque el vial de vidrio que contiene los lípidos y el baño de hielo en el recinto del sonicador de la sonda y sumerja la punta de la sonda debajo del miniscus. Asegúrese de que los lados de la sonda sonicadora no toquen el borde del vial de vidrio.
  7. La sonda sonica la mezcla con los siguientes ajustes: Amplitud 1, Tiempo de proceso: 20 s, Pulso encendido: 1s, Pulso apagado: 5s. Luego sonicar en los siguientes ajustes: Amplitud: 50, Tiempo de proceso: 5 s, Pulso encendido: 1 s, Pulso apagado: 10 s.
  8. Transfiera la solución de nanogotas a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos para separar las gotas más grandes (>1 μm) de las gotas más pequeñas.
  9. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a otro tubo de centrífuga de 1,5 ml. Lavar el sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 5 min para granular todas las gotas en solución. Resuspender los PFCnD en 1 ml de PBS pipeteando el pellet hacia arriba y hacia abajo y luego sonicar en un sonicador de baño durante 1 min.
  10. Mida el tamaño de las gotas utilizando la dispersión dinámica de luz (DLS). Diluir el stock de PFCnDs en 100 veces (10 μL de PFCnD en 990 μL de PBS) y bañar el sonicado para dispersar los PFCnDs antes de medir. Los resultados representativos se muestran en la Figura 1.
  11. Determine la concentración de los PFCnD utilizando el analizador de seguimiento de nanopartículas (consulte la Tabla de materiales). Diluya los PFCnD entre 100 y 1000 veces para garantizar una medición precisa de la concentración. El protocolo típicamente produce gotitas a una concentración del orden de 1010 partículas / ml.
  12. Prepare 10 ml de gel de acoplamiento de ultrasonido en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregue 1% (v / v) o 100 μL de PFCnD para hacer una solución de ~ 108 partículas / ml. Vórtice la solución a mezclar. Centrifugar la mezcla a 4000 x g durante 3 min para eliminar las burbujas.

2. Preparación fantasma de poliacrilamida

  1. Desgasifique el agua llenando un matraz de vacío de 500 ml con 400 ml de agua desionizada, selle con un corcho de goma y conecte el matraz a la línea de vacío. Abra la línea de vacío y sumerja el fondo del matraz en el sonicador de baño. Sonicar durante 5 minutos o hasta que no se vea la formación de burbujas de gas.
  2. Prepare una solución de persulfato de amonio al 10% (APS) disolviendo 500 mg en 5 ml de agua desgasificada. Agite suavemente la solución si el persulfato de amonio no se disuelve completamente.
  3. En un vaso de precipitados de 400 ml con una barra de agitación en una placa de agitación, agregue 150 ml de agua desgasificada y 50 ml de solución de acrilamida-bisacrilamida al 40% (p/v) para formar 200 ml de solución de acrilamida-bisacrilamida al 10%. Revuelva la mezcla a 200 rpm para permitir la mezcla adecuada sin introducir burbujas.
    PRECAUCIÓN: La acrilamida es un carcinógeno, y todo el trabajo debe hacerse en una campana extractora con guantes, especialmente si se trabaja con acrilamida en forma de polvo.
  4. Pesar 400 mg de sílice y añadirlo a la solución de acrilamida-bisacrilamida al 10% del paso 2.3 para formar una solución de sílice y acrilamida al 0,2% (p/v).
    PRECAUCIÓN: La sílice cuando se inhala puede ser un carcinógeno. Todo el trabajo, incluido el pesaje, debe realizarse en una campana extractora.
  5. Prepare un molde cuadrado de 58 mm x 58 mm x 78 mm con una inclusión cilíndrica cortando las puntas de una pipeta de transferencia de plástico y apoyándola en el molde con cinta de laboratorio. Consulte la figura 2.
  6. Agregue 2 ml de solución de APS al 10% al vaso de precipitados para obtener una concentración final de 0.1% de APS y agregue 250 μL de tetrametiletilendiamina (TEMED) a la solución fantasma. Deje que la solución se agite brevemente (menos de un minuto).
  7. Vierta rápidamente la solución en el molde, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución. La solución debe polimerizarse en 10 min. Retire el fantasma pasando el extremo plano de una espátula de laboratorio alrededor del borde del molde e invirtiendo el molde.
    NOTA: Estos fantasmas se pueden reutilizar varias veces y deben sumergirse en agua y almacenarse a 4 ° C.

3. Imágenes de nanogotas de perfluorocarbono

  1. Encienda y caliente el sistema láser pulsado durante ~ 20 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que el haz de fibra óptica esté conectado correctamente a la salida del láser y que las dos patas estén colocadas correctamente dentro del soporte del haz de fibra.
  2. Encienda el sistema de imágenes de ultrasonido, conecte el transductor de imágenes de matriz (L11-4v) al sistema y fije el transductor dentro del soporte para alinear su plano de imágenes con la sección transversal del láser.
  3. Ajuste la frecuencia de repetición de pulso del sistema láser a 10Hz y coloque un medidor de potencia al final del haz de fibra para medir la energía. Sintoniza el retardo q-switch hasta que la fluencia estimada sea de 70 mJ/cm2.
    PRECAUCIÓN: Se deben usar gafas adecuadas al disparar el láser y las cortinas láser deben encerrar el espacio.
  4. Rellene uno de los canales en el fantasma de poliacrilamida con la mezcla de gel de ultrasonido/PFCnD usando una jeringa de punta deslizante de plástico de 1 ml. Cubra generosamente la parte superior del canal con gel de ultrasonido y elimine cualquier burbuja con una jeringa de punta deslizante de plástico de 1 ml. Coloque el fantasma de poliacrilamida debajo del transductor y el haz de fibras, como se muestra en la Figura 3.
  5. Utilice la plataforma combinada de imágenes de ultrasonido y elasticidad láser (CLUE) basada en el software20 para obtener imágenes PFCnD sincronizadas con activación óptica. Cambie los parámetros generales definidos por el usuario en la estructura de parámetros para imágenes: establezca la profundidad de inicio/fin en 0/40 mm, la frecuencia central en 6,9 MHz y el nombre del transductor en 'L11-4v'.
  6. Defina un nuevo RunCase y diseñe una secuencia de módulos para la activación/recondensación óptica repetida y la obtención de imágenes US de PFHnDs. Esto se hace enumerando módulos predefinidos como imágenes ultrarrápidas (mUF), láser externo (mExtLaser) e inactivo (mIdle).
    1. Repita el conjunto de secuencias mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF dos veces para adquirir datos de imágenes de n-pulso y p-pulso.
      NOTA: El primer módulo mExtLaser de cada secuencia se establece como un láser simulado configurando ExtLaser.Enable en 0 y se incluye 'mIdle' para minimizar el tiempo entre las imágenes de fondo de EE. UU. y las imágenes de EE. UU. de pulso n/p después de la activación del láser.
  7. Establezca los parámetros del módulo para cada módulo colocado en la secuencia de módulos del caso de ejecución actual. Acceda a cada parámetro del módulo por índice correspondiente a su orden en la secuencia de módulos. Los módulos ejecutarán operaciones predefinidas con los parámetros del módulo configurados por el usuario aquí.
    1. Establezca ExtLaser.QSdelay en módulos láser externos al valor del retardo del interruptor Q del láser sintonizado en el paso 3.3, en microsegundos. Este módulo espera a que se active la linterna del sistema láser y genera el disparador Q-switch después del retraso especificado en QSdelay.
    2. En el módulo de imágenes ultrarrápidas, establezca Resource.numFrame en 100, establezca SeqControl.PRI en 200 (μs) y establezca TW.polarity en 1 para el pulso P y -1 para el pulso N (consulte la figura 4 para la forma de pulso correspondiente). Este módulo transmitirá onda plana ultrarrápida de 0 grados con el tipo de pulso especificado en TW.polarity.
      1. Adquiera una ventana de imagen de apertura completa de 38,8 mm de ancho para el número de fotogramas en Resource.numFrame, intervalo de repetición de pulsos de SeqControl.PRI y, a continuación, guarde los datos para el procesamiento fuera de línea.
    3. Establezca SeqControl.lastPRI_Module en módulo inactivo en el período de tiempo entre pulsos láser (100 ms) restado por el retardo del interruptor Q, el tiempo de adquisición de datos de imágenes (20 ms) y un margen de 20 μs para que la señal viaje. Este módulo mantiene el sistema en estado de "no operación" durante el tiempo en SeqControl.lastPRI_Module para llenar el intervalo de tiempo entre el final de la adquisición de datos de imágenes y la próxima excitación de pulso láser.

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Representative Results

La formulación exitosa y la separación centrífuga de los PFCnD deberían producir gotas de alrededor del tamaño de 200-300 nm de diámetro (Figura 1A). Las gotitas mal separadas pueden mostrar pequeños picos alrededor de 1 μm. Estas soluciones se pueden sonicar aún más para romper las gotas más grandes. El tamaño de las gotitas aumentará con el tiempo debido a la coalescencia y/o difusión en un proceso conocido como maduración de Ostwald21,22 (Figura 1B).

La modulación acústica de las gotitas mediante la manipulación del pulso de imagen mejoró el contraste de los PFCnD vaporizados. Esto se demostró en imágenes de PFCnD reconstruidas restando fotogramas adyacentes de las imágenes formadas por haz de modo que solo la señal devuelta por PFCnD vaporizada es visible y la señal de fondo estacionaria se suprime. El contraste se cuantifica por la relación de la diferencia entre las señales promedio del área de inclusión circular y la señal de fondo promedio sobre la señal de fondo promedio. La señal de fondo se define por las señales de dos ROI rectangulares del fondo que están a la misma profundidad y área equivalente que las inclusiones. El contraste de la inclusión para el pulso N es aproximadamente 3,2 veces mayor (es decir, 220 % de mejora) que el pulso P (Figura 5).

El pulso de imagen invertido también aumentó la longevidad de la señal de vaporización de PFCnD. Esto se cuantificó mediante el umbral de los píxeles en la región de inclusión circular que excede la señal de fondo. El porcentaje de píxeles en la inclusión que estaba por encima del umbral se definió como el área hiperecoica (%). Para examinar el comportamiento hiperecogénico de los PFCnD a lo largo del tiempo, se calcula el área hiperecoica para cada fotograma y se normaliza mediante el área hiperecoica del primer fotograma, y luego se ajusta a un modelo de decaimiento exponencial. Esta función se utilizó para determinar el tiempo de decaimiento característico, definido como el lapso de tiempo que tarda el área hiperecoica después de la activación de PFCnD en decaer a solo el 10% del área inicial (Figura 6a). El tiempo de decaimiento característico del área hiperecoica normalizada es hasta 3,5 veces mayor en las imágenes de N-pulso en comparación con el pulso P. En la figura 6b se muestran fotogramas de imagen diferenciales representativos en modo B en el tiempo para cada imagen de pulso N y pulso P.

Figure 1
Figura 1: Mediciones del tamaño DLS de PFCnDs y estabilidad. (A) La distribución de la intensidad del tamaño de las gotas promediada a partir de tres mediciones de gotitas después de la síntesis (PDI promedio: 0.132± 0.016; promedio Z: 259.3 ± 0.7 nm). (B) La distribución de la intensidad del tamaño de las gotitas promediada a partir de tres mediciones tomadas 24 horas después de la síntesis (PDI promedio: 0.252± 0.061; promedio Z: 322.5 ± 4.5 nm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen y esquema del molde de poliacrilamida. (A) Imagen del molde hecho de cinta de laboratorio y el recipiente de plástico. (B) Esquema con mediciones del fantasma de poliacrilamida después de la eliminación del moho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Un esquema de la entrega de pulso láser y las imágenes de ultrasonido. (A) Los componentes del conjunto están etiquetados y se ilustra la alineación del plano de imágenes de rayo láser / ultrasonido en relación con la posición de inclusión. (B) Una imagen que muestra la configuración real. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Pulso de imagen de ultrasonido simulado. Las formas de onda son simuladas por el software del sistema de imágenes de ultrasonido, muestreadas por 250 MHz. La forma de onda del pulso P y el pulso N se generan con la misma frecuencia central y ancho de pulso, pero tienen una diferencia de fase de 180°. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Medición del contraste. Valor de contraste medio del área de inclusión para N-pulso y P-pulso, las barras de error representan la desviación estándar (n=3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Curva de decaimiento característica del área hiperecoica y magos diferenciales representativos en modo B . (A) Área hiperecoica normalizada inducida por la activación de PFCnD a lo largo del tiempo para imágenes de pulso N y pulso P en la misma sección transversal. La línea punteada indica el 10% del área hiperecoica inicial. El momento en que la gráfica ajustada se cruza con la línea punteada representa el tiempo de decaimiento característico. (B) Las imágenes muestran una ventana de ROI recortada centrada en la inclusión, trazada en una escala de dB con un rango dinámico de 35. La fila superior muestra el comportamiento de recondensación fotografiado por el pulso P y la fila inferior muestra el pulso N. La línea discontinua de color amarillo indica el área de inclusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Volumen total de Phantom (mL) 50 100 250 500
Agua DI (mL) 37.5 74.9 187.4 375
Solución de PA al 40% (mL) 12.5 25.1 62.6 125
Sílice (mg) 100 200 500 1000
Solución de APS al 10% (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

Tabla 1: Resumen de los reactivos y cantidades para la reticulación fantasma de poliacrilamida basada en el volumen del molde. Esta tabla proporciona un resumen conciso del valor de los reactivos utilizados y las cantidades basadas en varios volúmenes de moldes comunes.

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Discussion

La sonicación de la sonda es un método relativamente simple y fácil de aprender para fabricar PFCnDs. Hay algunos pasos en los que se debe tener cuidado. Al manipular cloroformo, es imperativo que se utilice una pipeta de desplazamiento positivo o jeringas de vidrio, ya que es volátil y se "filtrará" de las pipetas de desplazamiento de aire estándar. Además, si utiliza un desplazamiento positivo, asegúrese de que se utiliza una punta adecuada, ya que el cloroformo disolverá la mayoría de las puntas de plástico, lo que puede introducir contaminantes en la solución. También se recomienda una pipeta de desplazamiento positivo o una jeringa de vidrio para el perfluorohexano, ya que es volátil y más densa que el agua. Normalmente, los efectos individuales de la volatilidad y la alta densidad pueden reducirse mediante la humectación previa en pipetas de desplazamiento de aire y el uso de una escala para ajustar el volumen establecido en la pipeta, respectivamente. Pero en el caso del perfluorohexano, que posee ambas propiedades, la volatilidad dificultará la obtención de mediciones precisas del peso, lo que hace que una pipeta/jeringa de vidrio de desplazamiento positivo sea la opción más viable.

Antes de sonicar la solución por sonda, es importante incubar la solución de lípidos y perfluorocarbonos en un baño de hielo para permitir que se enfríe y evitar hervir el perfluorocarbono durante la sonicación. Este paso será especialmente importante para el perfluorocarbono de menor ebullición, como el perfluoropentano. Además, se debe tener cuidado al sondear la sonicación de la solución. La punta de la sonda de sonicación debe sumergirse, pero no debe hacer contacto con el fondo o los lados del vial de vidrio, ya que podría dañar la punta y romper el vial, vaciando la solución lipídica en el baño de hielo.

El protocolo de fabricación de PFCnD se puede adaptar de algunas maneras menores. Si un evaporador rotativo no está disponible en el paso 1.3, la solución puede secarse con un flujo constante de gas nitrógeno o colocarse en una cámara de vacío durante la noche para formar la torta lipídica. En cuanto a los lípidos, esta formulación utiliza una relación 9:1 de DSPE-PEG:DSPC en comparación con la relación estándar 1:9 de DSPE-PEG:DSPC, porque resulta en gotas más pequeñas y estables de mayor tamaño23. Esta formulación se puede adaptar para permitir la conjugación de la superficie sustituyendo una pequeña fracción (~ 2 mol%) del DSPE-PEG con un DSPE-PEG funcionalizado con la fracción deseada (por ejemplo, biotina, tiol, amina, etc.).

En general, los sonicadores de sonda están disponibles comercialmente, son relativamente simples de usar y se pueden adaptar fácilmente a otras formulaciones de perfluorocarbonos y surfactantes de punto de ebullición más alto, pero no se pueden usar para hacer gotas con núcleos de perfluorocarbono que son gaseosos a temperatura ambiente sin modificaciones significativas. Una de esas modificaciones es utilizar la sonicación de la sonda para crear microburbujas y luego aplicar presión y reducir la temperatura para condensar las microburbujas en gotas24. Si bien este método es una forma inteligente de generar gotas acústicamente vaporizables, es difícil encapsular suficiente tinte dentro de las microburbujas para garantizar ODV después de la condensación. Un enfoque alternativo es conjugar el colorante (por ejemplo, Cy7.5) a los lípidos y formar microburbujas que se pueden condensar en PFCnDs25 de bajo punto de ebullición con capacidad ODV.

La sonicación de la sonda también produce una alta concentración de nanogotas (~ 1010 gotas / ml) en un período de tiempo relativamente corto. Sin embargo, esta técnica da como resultado una gran distribución de tamaño que reducirá la cantidad de nanogotas que se extravasarán. Mientras que esto puede mejorarse a través del filtrado centrífugo o filtros de jeringa para eliminar gotas más grandes, los PFCnD resultantes exhibirán una mayor polidispersidad en comparación con las gotas sintetizadas usando microfluídica o filtradas a través de extrusión26. Otro inconveniente de la sonicación de la sonda es que la punta de la sonda de sonicación inevitablemente se picará por cavitación durante la sonicación y deberá reemplazarse periódicamente.

Un enfoque alternativo para crear gotas utiliza dispositivos microfluídicos que se pueden usar para adaptar gotas a un tamaño específico con un bajo índice de polidispersidad (PDI). Sin embargo, estos dispositivos producen gotitas a una velocidad relativamente lenta (~10 4-106 gotas / s)26 y, aunque ha habido varios desarrollos como la emulsificación escalonada 27, la transmisión de punta en dispositivos de enfoque de flujo28,29 y la utilización del efecto ouzo con un micromezclador de espiga escalonada30 - La generación de gotas de tamaño nanométrico sigue siendo un desafío. Además, esta técnica no está disponible comercialmente, y la fabricación de estos dispositivos requiere experiencia especializada.

Otros métodos que están disponibles comercialmente incluyen la extrusión y la homogeneización. La extrusión utiliza membranas para pasar gotas, lo que resulta en gotas de tamaño nanométrico con un rango de tamaño más estrecho en comparación con la sonicación. Sin embargo, este método depende en gran medida de la formulación y es difícil incorporar tinte o carga terapéutica dentro de la gota26. La homogeneización a alta presión hace uso de homogeneizadores disponibles comercialmente que utilizan alta presión y esfuerzo cortante para generar partículas lipídicas monodispersas a nanoescala de manera escalable31,32,33. Este método ha sido adaptado para crear gotitas con perfluorocarbonos de alto y bajo punto de ebullición32,34. Una revisión más sustancial de los métodos de formulación de gotitas y los protocolos de muestra se puede encontrar en la siguiente revisión26.

Los fantasmas son una herramienta valiosa para caracterizar el rendimiento de las nanogotas in vitro. En este protocolo, se utilizan fantasmas a base de poliacrilamida con sílice. Los problemas más frecuentes con los fantasmas de poliacrilamida están relacionados con la polimerización lenta o nula. La polimerización lenta, aunque menos problemática, puede conducir a una distribución heterogénea de la dispersión incrustada. El culpable más común de este problema es el uso de soluciones antiguas de persulfato de amonio que reducen la producción de radicales libres que inician la reticulación. Esto se puede abordar fácilmente haciendo que la solución sea fresca o no usando soluciones preparadas que tengan más de una semana. Otra posibilidad es la degradación de TEMED, esto será evidente en la formación de un precipitado amarillo. Otro problema común es la presencia de burbujas de aire en el fantasma polimerizado. La desgasificación adecuada del agua y el manejo cuidadoso para evitar el exceso de agitación superficial deberían mitigar este problema. Una estrategia alternativa sería desgasificar toda la solución después del paso 2.5. Sin embargo, esto debe realizarse en una campana extractora debido a la presencia de acrilamida.

Estos fantasmas también son excelentes para obtener imágenes del comportamiento de gotitas restringidas para estudiar el comportamiento individual de las gotas; esto se puede hacer agregando PFCnDs en el fantasma en el paso 2.4. Además, dado que la reticulación se debe a una reacción química, se produce relativamente poco calor en comparación con una reticulación física basada en una temperatura de solución crítica superior como la gelatina. Esto reduce la probabilidad de vaporización espontánea de las gotitas incrustadas.

Si bien hay una variedad de métodos para sintetizar fantasmas, la poliacrilamida produce un fantasma relativamente duradero y no degradable que posee baja atenuación acústica35 y coeficiente de absorción óptica36. Estas propiedades pueden ajustarse para imitar más de cerca las propiedades acústicas y ópticas del tejido humano ajustando la concentración de la solución final de poliacrilamida y mediante la inclusión de partículas en el fantasma como sílice, perlas de vidrio o dióxido de titanio36. Además, las propiedades mecánicas de los fantasmas pueden ajustarse modificando el porcentaje de contenido de polímero (es decir, porcentaje de acrilamida y bis(acrilamida)) y el porcentaje de reticulante (es decir, porcentaje de bis(acrilamida) en el contenido total de polímeros)37. Los fantasmas alternativos incluyen, entre otros, agar38, gelatina39, alcohol polivinílico (PVA)40, etc.

Los pasos críticos para una imagen exitosa de la distribución de PFCnD activada y la dinámica hiperecogénica son los siguientes. 1) Sincronice el sistema láser (fuente de activación) y el sistema de imágenes de ultrasonido. 2) Alinee la sección transversal del láser tanto con la región objetivo de interés como con el plano de imagen de ultrasonido. 3) Ajuste los parámetros de imagen de ultrasonido propios de las imágenes PFCnD (es decir, velocidad de fotogramas, forma de onda de pulso, etc.).

La activación óptica de PFCnD tiene una ventaja notable sobre los activados acústicamente que puede evadir la interferencia acústica que degrada drásticamente la calidad de la imagen de ultrasonido mientras observa su fase de recondensación en el tiempo. Sin embargo, es difícil integrar y alinear el sistema láser con el sistema de imágenes de ultrasonido tanto espacial como temporalmente. El uso de un soporte impreso en 3D permite una entrega de luz repetible y controlada. La entrega de luz también se puede solucionar insertando una varilla de metal en la inclusión en el fantasma de poliacrilamida, ya que la varilla de metal debe producir contraste fotoacústico para indicar la entrega de luz. La sincronización temporal se logró construyendo a partir de una plataforma20 previamente desarrollada, que permite tanto la sincronización del sistema láser como del sistema de imágenes, manteniendo la programabilidad completa del sistema de imágenes Verasonics con una interfaz fácil de usar. Además, el programa proporciona imágenes convencionales en modo B en tiempo real e imágenes fotoacústicas para ayudar a solucionar problemas y localizar la región de interés donde se distribuyen los PFCnD. Sin embargo, esta configuración requiere un láser pulsado externo de nanosegundos. Actualmente, hasta donde sabemos, hay algunos sistemas comerciales que han integrado sistemas de imágenes láser-ultrasonido que pueden permitir imágenes PFCnD, por ejemplo, Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 e iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF e inVision 512-echo).

Las imágenes de ultrasonido ultrarrápidas del comportamiento de vaporización-recondensación de PFCnD sufren principalmente de baja sensibilidad. Si bien las soluciones más comunes para la mejora de la sensibilidad de la imagen incluyen la composición de fotogramas múltiples, esas técnicas están limitadas por su característica inherente de degradar la velocidad de fotogramas, ya que la imagen PFCnD es altamente vulnerable para los artefactos de movimiento en el sentido de que incluye un proceso diferencial de tiempo. La modulación de polaridad de pulso en nuestro protocolo aborda eficazmente este problema en las imágenes de PFCnD al aprovechar la dinámica acústica de los PFCnD vaporizados para tener una imagen más discriminable y prolongada sin afectar la resolución temporal en absoluto.

Mientras que ODV permite gotas con capacidades únicas como vaporización repetida y contraste fotoacústico, el método de activación tiene una penetración de profundidad limitada en comparación con el ultrasonido. Como la penetración de la luz es limitada, esto restringe las aplicaciones a procedimientos principalmente superficiales, como un reemplazo para la biopsia del ganglio linfático centinela41. Esta limitación puede evitarse potencialmente a través de sistemas de administración de luz basados en catéteres, lo que permite la activación profunda en el tejido. Dado que el contraste es acústico, la vaporización podrá ser fotografiada a una profundidad comparable a la ADV. Una técnica de activación alternativa puede ser la vaporización de gotas magnéticas, en la que los agentes de contraste magnético como las nanopartículas de óxido de hierro se encapsulan dentro de la gota42. Esto permitirá la vaporización a cualquier profundidad.

En el futuro, la capacidad de nuestro protocolo para obtener imágenes y modular la respuesta hiperecogénica de PFCnD al mismo tiempo se puede utilizar para varias aplicaciones donde se requiere monitoreo y manipulación de PFCnD. Por ejemplo, un tiempo detectable más largo puede mejorar la calidad de imagen de las imágenes de súper resolución al dar un mayor número de fotogramas al promedio. Además, un control más preciso de PFCnD tiene el potencial de elevar la eficiencia y la seguridad de las terapias mediadas por burbujas, como la apertura de BBB y la administración de fármacos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo fue apoyado en parte por la Fundación para la Investigación del Cáncer de Mama bajo la subvención BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

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References

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Formulación y modulación acústica de nanogotas de perfluorocarbono vaporizadas ópticamente
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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S.… More

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

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