使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产和纯化腺相关病毒（AAV）2载体的工艺开发
Summary
在该协议中，通过将 Spodoptera frugiperda（Sf9） 昆虫细胞与杆状病毒（BV）-AAV2-绿色荧光蛋白（GFP）或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap感染的Sf9细胞在悬浮培养物中共同培养来产生AAV2载体。使用洗涤剂从细胞中释放AAV颗粒，澄清，通过亲和柱色谱纯化，并通过切向流过滤浓缩。
Abstract
腺相关病毒（AAV）是基因治疗应用的有前途的载体。在这里，AAV2载体是通过在无血清悬浮培养物中共培养 Spodoptera frugiperda（Sf9） 细胞与感染杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗基因）和BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞共培养产生的。细胞在轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中培养。为了释放AAV颗粒，将生产者细胞裂解在含有洗涤剂的缓冲液中，随后通过低速离心和过滤进行澄清。使用AVB Sepharose柱色谱法从细胞裂解物中纯化AAV颗粒，其结合AAV颗粒。用PBS洗涤结合的颗粒以除去污染物，并使用柠檬酸钠缓冲液在pH 3.0下从树脂中洗脱。酸性洗脱液用碱性Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中和，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释，并用切向流动过滤（TFF）进一步浓缩。该协议描述了小规模的临床前载体生产与用于人类基因治疗应用的大规模临床级AAV制造相容。
Introduction
腺相关病毒（AAV）是非包膜的人类细小病毒，含有4.6 kb的单链DNA。对于基因治疗应用，AAV载体比其他病毒载体具有几个优点1，2，3，4。AAV自然是复制无能的，因此，需要帮助病毒和主机进行复制。AAV不会引起任何疾病，并且在受感染的宿主3，5中具有低免疫原性。AAV可以感染静止和主动分裂的细胞，并且可以持续作为表观体而不整合到宿主细胞的基因组中（AAV很少整合到宿主基因组中）1，3。这些特性使AAV成为基因治疗应用的理想工具。
为了生成AAV基因转移载体，在两个内部末端重复序列（ITR）之间克隆转基因盒，包括治疗基因，这两个重复序列通常来自AAV血清型2。从5’ITR到3’ITR的最大尺寸，包括转基因序列，为4.6 kb6。不同的衣壳可能具有不同的细胞或组织向性。因此，应根据拟用AAV载体靶向的组织或细胞类型选择衣壳7。
重组AAV载体通常在哺乳动物细胞系中产生，例如人胚胎肾细胞，HEK293通过AAV基因转移载体，AAV rep-cap和辅助病毒质粒2，3的瞬时转染。然而，通过贴壁HEK293细胞的瞬时转染进行大规模AAV生产存在一些局限性。首先，需要大量的电池堆或滚瓶。其次，需要高质量的质粒DNA和转染试剂，这增加了制造成本。最后，当使用贴壁HEK293细胞时，血清经常需要最佳生产，使下游处理1，2，3复杂化。AAV制造的替代方法涉及使用昆虫细胞系，Spodoptera frugiperda（Sf9）细胞，以及称为重组Autographa californica多衣壳核多肝病病毒（AcMNPV或杆状病毒）的昆虫病毒8，9，10。Sf9细胞在无血清悬浮培养物中生长，易于放大，并且与当前大规模的良好生产规范（cGMP）生产兼容，不需要质粒或转染试剂。此外，使用Sf9-杆状病毒系统的AAV生产成本低于使用质粒瞬时转染到HEK293细胞的成本11。
原来的rAAV生产系统使用杆状病毒-Sf9细胞，使用三种杆状病毒：一种是含有基因转移盒的杆状病毒，第二种是含有重复基因的杆状病毒，第三种杆状病毒含有血清型特异性衣壳基因12、13。然而，含有重复构建体的杆状病毒在多轮传代时遗传不稳定，这阻止了杆状病毒在大规模AAV生产中的扩增。为了解决这个问题，开发了一种新型的rAAV载体系统，其中包含两种杆状病毒（TwoBac）：一种含有AAV基因转移盒的杆状病毒和另一种含有AAV重集基因的杆状病毒，它们在遗传上比原始系统更稳定，并且由于使用TwoBac而不是三个14，因此更方便产生rAAV。 15.OneBac系统使用单个杆状病毒中的AAV基因转移盒和rep-cap基因，由于使用一种杆状病毒而不是使用TwoBac或ThreeBac2，16，17，因此更方便地产生rAAV。在我们的研究中，TwoBac系统用于优化。
用于AAV生产的杆状病毒系统也有局限性：杆状病毒颗粒在无血清培养基11中长期储存不稳定，如果杆状病毒滴度低，则需要大量的杆状病毒上清液，这可能在AAV生产过程中对Sf9细胞的生长产生毒性（个人观察）。使用无滴度感染细胞保存和放大（TIPS）细胞或杆状病毒感染的昆虫细胞（BIIC）为AAV生产提供了一个很好的选择，其中制备杆状病毒感染的Sf9细胞，冷冻保存，随后用于感染新鲜的Sf9细胞。另一个优点是冷冻保存后Sf9细胞中杆状病毒（BV）的稳定性增加10，11。
产生两种类型的TIPS细胞以实现AAV的产生：第一种是通过感染具有BV-AAV2-GFP或治疗基因的Sf9细胞，第二种是通过具有BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞感染的。TIPS细胞被冷冻保存在小型和即用型等分试样中。AAV载体通过共培养产生杆状病毒和新鲜Sf9细胞的TIPS细胞，在置于轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中以无血清悬浮培养物产生。Sf9细胞被携带AAV2-GFP载体和重复帽序列以产生AAV的杆状病毒感染。四到五天后，当AAV产量最高时，用洗涤剂裂解生产细胞以释放AAV颗粒。随后通过低速离心和过滤澄清细胞裂解物。AAV颗粒通过AVB琼脂糖柱色谱法从裂解物中纯化。最后，使用TFF浓缩AAV载体。该协议描述了AAV的小规模生产，可用于研究和临床前研究。然而，这些方法是可扩展的，并且与制造用于基因治疗应用的临床级AAV载体兼容。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议中用于AAV载体生产，纯化和浓缩过程开发的参数可应用于基因治疗应用的AAV载体的小型和大规模制造。整个上游和下游过程可以在与当前良好生产规范（cGMP）兼容的封闭系统中执行。Sf9-杆状病毒系统的主要优点是可扩展性，能够以可承受的成本进行大规模的GMP级AAV生产。该系统不需要昂贵的质粒和转染试剂，而使用HEK293细胞生产AAV则需要这些质粒和转染试剂。据报道，HEK293细胞和Sf9细胞?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Robert M. Kotin博士（国家心脏，血液和肺部研究所，NIH）慷慨地为我们提供了AAV质粒，并感谢Danielle Steele和Rebecca Ernst（辛辛那提儿童医院）的技术援助。这项工作得到了辛辛那提儿童研究基金会（Cincinnati Children’s Research Foundation）到M.N.的启动基金的支持。
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
Riferimenti
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
