Sviluppo del processo per la produzione e la purificazione del vettore adeno-associato al virus (AAV)2 utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto
Summary
In questo protocollo, il vettore AAV2 è prodotto co-coltivando cellule di insetti Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) o gene terapeutico e cellule Sf9 infette da BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione. Le particelle AAV vengono rilasciate dalle cellule utilizzando detergente, chiarificate, purificate mediante cromatografia a colonna di affinità e concentrate mediante filtrazione a flusso tangenziale.
Abstract
I virus adeno-associati (AAV) sono vettori promettenti per le applicazioni di terapia genica. Qui, il vettore AAV2 è prodotto dalla co-coltura di cellule di Spodoptera frugiperda (Sf9) con cellule Sf9 infettate da baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gene terapeutico) e BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione senza siero. Le cellule vengono coltivate in un pallone in uno shaker orbitale o in un bioreattore Wave. Per rilasciare le particelle AAV, le cellule produttrici vengono lisate in un tampone contenente detergente, che viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato cellulare utilizzando la cromatografia a colonna AVB Sepharose, che lega le particelle AAV. Le particelle legate vengono lavate con PBS per rimuovere i contaminanti ed eluite dalla resina utilizzando un tampone di citrato di sodio a pH 3,0. L’eluato acido viene neutralizzato con tampone alcalino Tris-HCl (pH 8,0), diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e ulteriormente concentrato con filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Il protocollo descrive la produzione di vettori pre-clinici su piccola scala compatibile con la produzione AAV di grado clinico su larga scala per applicazioni di terapia genica umana.
Introduction
I virus adeno-associati (AAV) sono parvovirus umani non avvolti contenenti un DNA a singolo filamento di 4,6 kb. I vettori AAV hanno diversi vantaggi rispetto ad altri vettori virali per applicazioni di terapiagenica 1,2,3,4. Gli AAV sono naturalmente incompetenti per la replicazione, quindi richiedono un virus helper e un meccanismo ospite per la replicazione. Gli AAV non causano alcuna malattia e hanno una bassa immunogenicità nell’ospite infetto3,5. L’AAV può infettare sia le cellule quiescenti che quelle che si dividono attivamente e può persistere come episoma senza integrarsi nel genoma delle cellule ospiti (AAV raramente si integra nel genoma dell’ospite)1,3. Queste caratteristiche hanno reso AAV uno strumento desiderabile per le applicazioni di terapia genica.
Per generare un vettore di trasferimento genico AAV, la cassetta transgenica, incluso il gene terapeutico, viene clonata tra due ripetizioni terminali interne (ITR), che sono tipicamente derivate dal sierotipo AAV 2. La dimensione massima da 5′ ITR a 3′ ITR, compresa la sequenza transgenica, è 4,6 kb6. Capsidi diversi possono avere un diverso tropismo cellulare o tissutale. Pertanto, i capsidi dovrebbero essere scelti in base al tessuto o al tipo di cellula destinati ad essere presi di mira con il vettore AAV7.
I vettori AAV ricombinanti sono comunemente prodotti in linee cellulari di mammiferi come le cellule renali embrionali umane, HEK293 per trasfezione transitoria del vettore di trasferimento genico AAV, AAV rep-cap e plasmidi del virus helper2,3. Tuttavia, ci sono diverse limitazioni per la produzione di AAV su larga scala mediante trasfezione transitoria di cellule HEK293 aderenti. In primo luogo, è necessario un gran numero di pile di celle o bottiglie a rulli. In secondo luogo, sono necessari DNA plasmidico di alta qualità e reagenti di trasfezione, il che aumenta il costo di produzione. Infine, quando si utilizzano cellule HEK293 aderenti, il siero è spesso necessario per una produzione ottimale, complicando la lavorazione a valle1,2,3. Un metodo alternativo di produzione AAV prevede l’utilizzo della linea cellulare di insetti, cellule Spodoptera frugiperda (Sf9) e un virus di insetti chiamato virus ricombinante Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Le cellule Sf9 sono coltivate in colture in sospensione senza siero che è facile da scalare ed è compatibile con l’attuale produzione di buone pratiche di fabbricazione (cGMP) su larga scala, che non richiede plasmidi o reagenti di trasfezione. Inoltre, il costo della produzione di AAV utilizzando il sistema Sf9-baculovirus è inferiore al costo dell’utilizzo della trasfezione transitoria di plasmidi in cellule HEK29311.
Il sistema di produzione rAAV originale che utilizzava cellule baculovirus-Sf9 utilizzava tre baculovirus: un baculovirus contenente cassetta di trasferimento genico, il secondo baculovirus contenente gene rep e il terzo baculovirus contenente il gene del capside sierotipo specifico12,13. Tuttavia, il costrutto di rep contenente baculovirus era geneticamente instabile su più cicli di passaggi, il che impediva l’amplificazione del baculovirus per la produzione di AAV su larga scala. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un nuovo sistema vettoriale rAAV, che conteneva due baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenente la cassetta di trasferimento genico AAV e un altro baculovirus contenente i geni AAV rep-cap insieme che sono geneticamente più stabili del sistema originale e più convenienti per produrre rAAV a causa dell’utilizzo di TwoBac invece di tre14, 15. Il sistema OneBac utilizza la cassetta di trasferimento genico AAV e i geni rep-cap in un singolo baculovirus che è più conveniente per produrre il rAAV a causa dell’utilizzo di un baculovirus invece di utilizzare TwoBac o ThreeBac2,16,17. Nel nostro studio, il sistema TwoBac è stato utilizzato per l’ottimizzazione.
Il sistema di baculovirus per la produzione di AAV ha anche dei limiti: le particelle di baculovirus sono instabili per la conservazione a lungo termine nel mezzo privo di siero11e se il titolo del baculovirus è basso, è necessario un grande volume di surnatante di baculovirus, che può diventare tossico per la crescita delle cellule Sf9 durante la produzione di AAV (osservazione personale). L’uso di cellule TIPS (Tip) senza titolo di conservazione e scale-up delle cellule infette da titolo, o cellule di insetti infette da baculovirus (BIIC), fornisce una buona opzione per la produzione di AAV in cui le cellule Sf9 infette da baculovirus vengono preparate, crioconservate e successivamente utilizzate per l’infezione di cellule Sf9 fresche. Un altro vantaggio è la maggiore stabilità del baculovirus (BV) nelle cellule Sf9 dopo crioconservazione10,11.
Vengono generati due tipi di cellule TIPS per consentire la produzione di AAV: la prima per infezione di cellule Sf9 con il BV-AAV2-GFP o gene terapeutico, e la seconda per infezione della cellula Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Le cellule TIPS sono crioconservate in aliquote piccole e pronte all’uso. I vettori AAV sono prodotti in coltura di sospensione priva di siero in un pallone posto in uno shaker orbitale o bioreattore Wave co-coltivando cellule TIPS che producono baculovirus e cellule Sf9 fresche. Le cellule Sf9 sono infettate da baculovirus che trasportano il vettore AAV2-GFP e le sequenze rep-cap per generare AAV. Quattro o cinque giorni dopo, quando le rese AAV sono le più alte, le cellule produttrici vengono lisate con detergente per rilasciare le particelle AAV. Il lisato cellulare viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato mediante cromatografia a colonna di sefarosio AVB. Infine, i vettori AAV sono concentrati utilizzando TFF. Il protocollo descrive la produzione di AAV su piccola scala, utile per la ricerca e gli studi pre-clinici. Tuttavia, i metodi sono scalabili e compatibili con la produzione di vettori AAV di grado clinico per applicazioni di terapia genica.
Protocol
Representative Results
Discussion
I parametri utilizzati in questo protocollo per lo sviluppo del processo di produzione, purificazione e concentrazione di vettori AAV possono essere applicati sia alla produzione su piccola che su larga scala di vettori AAV per applicazioni di terapia genica. L’intero processo a monte e a valle può essere eseguito in un sistema chiuso compatibile con le attuali Good Manufacturing Practices (cGMP). I principali vantaggi del sistema Sf9-baculovirus sono la scalabilità per la produzione di AAV di livello GMP su larga scal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) per averci generosamente fornito i plasmidi AAV e Danielle Steele e Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato dal fondo Start-Up dalla Cincinnati Children’s Research Foundation a M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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