פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וירוס הקשורים לאדנו (AAV)2 וקטור באמצעות מערכת תרבית תאים של חרקים בקלווירוס
Summary
בפרוטוקול זה, וקטור AAV2 מיוצר על ידי פולחן שותף Spodoptera frugiperda (Sf9) תאים חרקים עם baculovirus (BV)-AAV2-חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או גן טיפולי ותאי Sf9 נגועים BV-AAV2-rep בתרבית השעיה. חלקיקי AAV משתחררים מהתאים באמצעות חומר ניקוי, מובהר, מטוהר על ידי כרומטוגרפיה של עמודת זיקה, ומרוכזים על ידי סינון זרימה משיק.
Abstract
וירוסים הקשורים אדנו (AAV) הם וקטורים מבטיחים עבור יישומי ריפוי גנטי. כאן, וקטור AAV2 מיוצר על ידי תרבית משותפת של תאי Spodoptera frugiperda (Sf9) עם תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס (BV)-AAV2-GFP (או גן טיפולי) ו- BV-AAV2-rep-cap בתרבית מתלים ללא סרום. תאים מתורבתים בבקבוקון בשייקר מסלולי או ביו-ריאקטור גלים. כדי לשחרר את חלקיקי AAV, תאי היצרן הם lysed במאגר המכיל חומר ניקוי, אשר מובהר לאחר מכן על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינון. חלקיקי AAV מטוהרים מהתא ליסאט באמצעות כרומטוגרפיה של עמודי AVB ספרוז, הקושרת חלקיקי AAV. חלקיקים קשורים נשטפים עם PBS כדי להסיר מזהמים ונבהרים מהשרף באמצעות חיץ נתרן סיטראט ב- pH 3.0. האלואט החומצי מנוטרל עם חיץ Tris-HCl אלקליין (pH 8.0), מדולל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), ומרוכז עוד יותר עם סינון זרימה משיק (TFF). הפרוטוקול מתאר ייצור וקטורי פרה-קליני בקנה מידה קטן התואם לייצור AAV בקנה מידה גדול עד בקנה מידה קליני עבור יישומי טיפול גנטי אנושי.
Introduction
וירוסים הקשורים לאדנו (AAV) הם פרובווירוסים אנושיים שאינם עוטפים המכילים DNA חד-גדילי של 4.6 kb. לווקטורים AAV יש מספר יתרונות על פני וקטורים ויראליים אחרים עבוריישומי ריפוי גנטי 1,2,3,4. AAVs אינם כשירים באופן טבעי לשכפול, ובכך דורשים וירוס עוזר ומכונות מארחות לשכפול. AAVs אינם גורמים לשום מחלה ויש להם אימונוגניות נמוכה במארח הנגוע3,5. AAV יכול להדביק תאים שיבונים וחלוקה פעילה ועשויים להימשך כאפיוזום מבלי להשתלב בגנום של התאים המארחים (AAV לעתים רחוקות להשתלב בגנום המארח)1,3. תכונות אלה הפכו את AAV לכלי רצוי עבור יישומי ריפוי גנטי.
כדי ליצור וקטור העברת גנים AAV, קלטת transgene, כולל הגן הטיפולי, משובטת בין שתי חזרות מסוף פנימיות (ITRs), אשר נגזרות בדרך כלל סרוטיפ AAV 2. הגודל המרבי מ- ITR בגודל 5 אינץ’ ל- ITR של 3 אינץ’, כולל רצף הטרנסג’נים, הוא 4.6 kb6. קפידים שונים עשויים להיות תא אחר או טרופיזם רקמה. לכן, capsids צריך להיבחר בהתבסס על הרקמה או סוג התא שנועד להיות ממוקד עם וקטור AAV7.
וקטורים AAV רקומביננטיים מיוצרים בדרך כלל בקווי תאים של יונקים כגון תאי כליה עובריים אנושיים, HEK293 על ידי העברה ארעית של וקטור העברת הגנים AAV, כובע נציג AAV, ווירוס עוזר plasmids2,3. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לייצור AAV בקנה מידה גדול על ידי ארעיות של תאי HEK293 חסידים. ראשית, יש צורך במספר רב של ערימות תאים או בקבוקי רולר. שנית, יש צורך בדנ”א פלסמיד באיכות גבוהה ובריגנטים של טרנספקטים, מה שמגדיל את עלות הייצור. לבסוף, בעת שימוש בתאי HEK293 דבקים, הסרום נחוץ לעתים קרובות לייצור אופטימלי, מה שמסבך את העיבוד במורד הזרם1,2,3. שיטה חלופית של ייצור AAV כוללת שימוש בקו תאי החרק, תאי Spodoptera frugiperda (Sf9), ווירוס חרקים הנקרא רקומביננטי חתימה californica וירוס polyhedrosis גרעיני multicapsid (AcMNPV או baculovirus)8,9,10. תאי Sf9 גדלים בתרבית מתלים ללא סרום שקל להגדיל ותואם לייצור בפועל הייצור הטוב הנוכחי (cGMP) בקנה מידה גדול, שאינו דורש ריאגנטים פלסמיד או טרנספקטו. יתר על כן, העלות של ייצור AAV באמצעות מערכת Sf9-baculovirus נמוכה יותר מאשר העלות של שימוש transfection חולף של plasmids לתוך HEK293 תאים11.
מערכת הייצור המקורית של rAAV באמצעות תאי baculovirus-Sf9 השתמשה בשלושה בקולווירוסים: בקולווירוס אחד המכיל קלטת העברת גנים, הבאקולווירוס השני המכיל גן נציג, ואת נגיף הבאקולו השלישי המכיל גן קפסיד ספציפי לסרוטיפ12,13. עם זאת, הבקולווירוס המכיל מבנה נציג היה לא יציב גנטית על סיבובים מרובים של מעברים, אשר מנע הגברה של baculovirus לייצור AAV בקנה מידה גדול. כדי לפתור בעיה זו, פותחה מערכת וקטורית rAAV חדשנית, שהכילה שני בקלווירוסים (TwoBac): אחד baculovirus המכיל את קלטת העברת הגנים AAV ועוד baculovirus המכיל את הגנים rep-cap AAV יחד אשר יציבים יותר מבחינה גנטית מאשר המערכת המקורית ונוח יותר לייצר rAAV בגלל שימוש TwoBac במקום שלושה14, 15. מערכת OneBac משתמשת בקלטת העברת הגנים AAV ובגנים של כובע נציגים בבאקולווירוס יחיד שנוח יותר לייצר את ה- rAAV בגלל שימוש בבאקולווירוס אחד במקום להשתמש ב- TwoBac או ThreeBac2,16,17. במחקר שלנו, מערכת TwoBac שימשה לאופטימיזציה.
מערכת baculovirus לייצור AAV יש גם מגבלות: חלקיקי baculovirus אינם יציבים לאחסון לטווח ארוך בינוני ללא סרום11, ואם titer baculovirus נמוך, יש צורך בנפח גדול של supernatant baculovirus, אשר עלול להיות רעיל לצמיחה של תאי Sf9 במהלך ייצור AAV (תצפית אישית). השימוש בתאי שימור תאים נגועים ללא טיטר והגדלת תאים (TIPS), או תאי חרקים נגועים בבקולווירוס (BIIC), מספק אפשרות טובה לייצור AAV שבהם תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס מוכנים, קריופ שמורים, ולאחר מכן משמשים לזיהום של תאי Sf9 טריים. יתרון נוסף הוא היציבות המוגברת של baculovirus (BV) בתאי Sf9 לאחר cryopreservation10,11.
שני סוגים של תאי TIPS נוצרים כדי לאפשר ייצור AAV: הראשון על ידי זיהום של תאי Sf9 עם BV-AAV2-GFP או גן טיפולי, והשני על ידי זיהום של תא Sf9 עם BV-AAV2-rep-cap. תאי טיפים שמורים ב aliquots קטן ומוכן לשימוש. וקטורים AAV מיוצרים בתרבית מתלים ללא סרום בבקבוקון להציב שייקר מסלולית או bioreactor גל על ידי כת משותפת תאי TIPS המייצרים baculoviruses ותאי Sf9 טריים. תאי Sf9 נגועים בבאקולווירוסים הנושאים את וקטור AAV2-GFP ואת רצפי כובע הנציג כדי ליצור AAV. ארבעה עד חמישה ימים לאחר מכן, כאשר תשואות AAV הן הגבוהות ביותר, תאי היצרן הם lysed עם חומר ניקוי כדי לשחרר את חלקיקי AAV. lysate התא מובהר לאחר מכן על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינון. חלקיקי AAV מטוהרים מהליסאט על ידי כרומטוגרפיה של עמודי AVB ספרוז. לבסוף, וקטורים AAV מרוכזים באמצעות TFF. הפרוטוקול מתאר את הייצור של AAV בקנה מידה קטן, שימושי למחקר ומחקרים פרה קליניים. עם זאת, השיטות ניתנות להרחבה ותואמות לייצור וקטורים AAV ברמה קלינית ליישומי ריפוי גנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרמטרים המשמשים בפרוטוקול זה לפיתוח תהליך הייצור, הטיהור והריכוז של וקטורים AAV ניתן להחיל הן ייצור קטן בקנה מידה גדול של וקטורים AAV עבור יישומי ריפוי גנטי. ניתן לבצע את כל התהליך במעלה ובמורד הזרם במערכת סגורה התואמת לנוהלי הייצור הטובים (cGMP) הנוכחיים. היתרונות העיקריים של מערכת Sf9-baculovirus ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר רוברט מ. קוטין (המכון הלאומי ללב, דם ולריאות, NIH) על שסיפק לנו בנדיבות את הפלסמידים של AAV ודניאל סטיל ורבקה ארנסט (בית החולים לילדים בסינסינטי) על הסיוע הטכני שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן הסטארט-אפ מקרן סינסינטי לחקר הילדים ל- M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
Riferimenti
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
