In vivo Metodi per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche e del nervo ottico in animali di grandi dimensioni

Summary

Qui mostriamo diversi test in vivo (potenziale evocato visivo flash, elettroretinogramma pattern e tomografia a coerenza ottica) in macaco di capra e rhesus per comprendere la struttura e la funzione del nervo ottico e dei suoi neuroni.

Abstract

Il nervo ottico raccoglie i segnali degli assoni dalle cellule gangliari retiniche e trasmette il segnale visivo al cervello. I grandi modelli animali di lesioni del nervo ottico sono essenziali per tradurre nuove strategie terapeutiche dai modelli di roditori all’applicazione clinica a causa delle loro somiglianze più strette con gli esseri umani in termini di dimensioni e anatomia. Qui descriviamo alcuni metodi in vivo per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche (RGC) e del nervo ottico (ON) in animali di grandi dimensioni, tra cui il potenziale evocato visivo (VEP), l’elettroretinogramma pattern (PERG) e la tomografia a coerenza ottica (OCT). Sia la capra che il primate non umano sono stati impiegati in questo studio. Presentando questi metodi in vivo passo dopo passo, speriamo di aumentare la riproducibilità sperimentale tra diversi laboratori e facilitare l’uso di grandi modelli animali di neuropatie ottiche.

Introduction

Il nervo ottico (ON), costituito da assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC), trasmette il segnale visivo dalla retina al cervello. Le malattie ON, come il glaucoma, la neuropatia ottica traumatica o ischemica, spesso causavano una degenerazione irreversibile di ON / RGC e una devastante perdita visiva. Sebbene attualmente ci siano molte scoperte nella rigenerazione ON e nella protezione RGC nei modelli di roditori1,2,3,4,5,6, i trattamenti clinici per la maggior parte delle malattie ON sono rimasti essenzialmente gli stessi nell’ultimo mezzo secolo con esiti insoddisfacenti7,8 . Per colmare il divario tra la ricerca di base e la pratica clinica, gli studi traslazionali che utilizzano modelli animali di grandi dimensioni di malattie ON sono spesso necessari e utili a causa della loro più stretta somiglianza anatomica con gli esseri umani rispetto ai modelli di roditori.

I macachi di capra e rhesus sono due grandi specie animali utilizzate nel nostro laboratorio per modellare la malattia ON dell’uomo. La dimensione del bulbo oculare di una capra, ON, e la struttura adiacente (cavità orbitale e nasale, base cranica, ecc.) è simile a quella di un essere umano basato sulla SCANSIONE TC del ^cranio9. Pertanto, il modello di capra offre l’opportunità di valutare e perfezionare i dispositivi terapeutici o le procedure chirurgiche prima dell’uso nell’uomo. Il macaco rhesus, come primate non umano (NHP), ha un sistema visivo unico simile all’uomo che non esiste in altre ^specie10,11. Inoltre, le risposte fisiopatologiche alle lesioni e ai trattamenti nella NHP sono molto simili a quelle degli esseri ^umani12.

I test in vivo per valutare longitudinalmente la struttura e la funzione dell’ON e dell’RGC sono importanti negli studi su animali di grandi dimensioni. L’elettroretinogramma di pattern (PERG) è stato utilizzato per valutare la funzione RGC. Il potenziale evocato visivo flash (FVEP) riflette l’integrità della via retino-genicolo-corticale nel sistema visivo. Pertanto, PERG combinato con FVEP può riflettere la funzione ON9,13,14 . La tomografia a coerenza ottica retinica (OCT) può mostrare la struttura retinica con un’elevata risoluzione temporale e spaziale, che consente la misurazione dello spessore del complesso gangliare retinico (GCC)^9,15. Per gli esami elettrofisiologici in questo studio, il monitoraggio dei segni vitali (tasso di calore, tasso di violazione, pressione sanguigna) e del livello di saturazione di ossigeno (SpO2) prima del test sono cruciali poiché questi parametri hanno potenti impatti sul flusso sanguigno oculare e quindi sulla funzione del sistema visivo. Tuttavia, non abbiamo monitorato i segni vitali durante l’esecuzione dell’imaging retinico OCT per motivi di semplicità. Secondo il nostro studio ^precedente9, lo spessore del GCC misurato dall’imaging retinico OCT è abbastanza stabile, con un coefficiente di variazione intersessione vicino al 3%. Questi test in vivo nel macaco di capra e rhesus sono stati descritti in dettaglio nel nostro studio ^precedente9. Qui presentiamo questi metodi per contribuire ad aumentare la trasparenza sperimentale e la riproducibilità.

Protocol

Gli esperimenti sono stati condotti rigorosamente in conformità con le linee guida ARRIVE e la guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso di animali da laboratorio e aderiscono ai protocolli approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee della Wenzhou Medical University (WMU) e del Joinn Laboratory (Suzhou). Le capre Saanen maschio, di età compresa tra 4 e 6 mesi con peso di 19-23 kg, sono state ospitate nella struttura per animali WMU. I macachi Rhesus maschi, di età compresa tra 5 e 6 an…

Representative Results

La Figura 1A mostra i risultati rappresentativi di FVEP nella capra. Sebbene le forme d’onda con la stessa intensità del flash abbiano una somiglianza relativa, raccomandiamo comunque di esaminare le forme d’onda due volte. Le onde elettromagnetiche generate dai dispositivi elettronici interferiranno con i segnali elettrici raccolti, con conseguente elevato rumore di base e scarsa ripetibilità della forma d’onda. Pertanto, si raccomanda di assicurarsi che non vi siano dispositivi elettroni…

Discussion

In questo studio, presentiamo un protocollo di VEP, PERG e OCT in capra e macaco rhesus. Questi metodi in vivo possono essere applicati in modelli animali di grandi dimensioni di varie neuropatie ottiche, come il glaucoma, la neuropatia ottica ischemica o traumatica e la neurite ^ottica9.

PVEP è più stabile e sensibile di ^FVEP17; tuttavia, non può essere suscitato in ^goat9. Come tale, FVEP viene eseguito in capr…

Materials

47.6 x 26.8 cm monitors	DELL Inc.	E2216HV	The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube	Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd	PVC 6.0	ensure the airway
alligator clip
atropine	Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd.		reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	2300 La Chaux-De-Fonds	ERG recording
eye speculum	Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd	ZYD020	open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system	Heidelberg Engineering		OCT system
Imaging			(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22	isoflurane anesthesia
male Saanen goats	Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China)		The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	U51-426-G-D	use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously	BD shanghai Medical Device Co., Ltd	383019	intravenous access for atropine and propofol
propofol	Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd.		induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device	Gotec Co., Ltd	GT-2008V-III	use for FVEP & PERG
xylazine	Huamu Animal Health Products Co., Ltd.		xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50	Virbac		induce Isoflurane anesthesia in monkey