In vivo Métodos para evaluar la función y estructura de las células ganglionares de la retina y el nervio óptico en animales grandes

Summary

Aquí demostramos varias pruebas in vivo (flash visual evoked potential, electrorretinograma de patrón y tomografía de coherencia óptica) en macaco cabra y rhesus para comprender la estructura y función del nervio óptico y sus neuronas.

Abstract

El nervio óptico recoge las señales de los axones de las células ganglionares de la retina y transmite la señal visual al cerebro. Los modelos animales grandes de lesión del nervio óptico son esenciales para traducir nuevas estrategias terapéuticas de modelos de roedores a la aplicación clínica debido a sus similitudes más cercanas con los humanos en tamaño y anatomía. Aquí describimos algunos métodos in vivo para evaluar la función y la estructura de las células ganglionares de la retina (RGC) y el nervio óptico (ON) en animales grandes, incluido el potencial evocado visual (VEP), el electrorretinograma de patrón (PERG) y la tomografía de coherencia óptica (OCT). Tanto la cabra como los primates no humanos fueron empleados en este estudio. Al presentar estos métodos in vivo paso a paso, esperamos aumentar la reproducibilidad experimental entre diferentes laboratorios y facilitar el uso de grandes modelos animales de neuropatías ópticas.

Introduction

El nervio óptico (ON), que consiste en axones de las células ganglionares de la retina (RGC), transmite la señal visual de la retina al cerebro. Las enfermedades ON, como el glaucoma, la neuropatía óptica traumática o isquémica, a menudo causaban degeneración irreversible de ON / RGC y pérdida visual devastadora. Aunque actualmente hay muchos avances en la regeneración de ON y la protección de RGC en modelos de roedores1,2,3,4,5,6, los tratamientos clínicos para la mayoría de las enfermedades ON se mantuvieron esencialmente iguales durante el último medio siglo con resultados insatisfactorios7,8 . Para llenar el vacío entre la investigación básica y la práctica clínica, los estudios traslacionales que utilizan modelos animales grandes de enfermedades ON a menudo son necesarios y beneficiosos debido a su similitud anatómica más cercana a los humanos que a los modelos de roedores.

Los macacos de cabra y rhesus son dos grandes especies animales utilizadas en nuestro laboratorio para modelar la enfermedad ON humana. El tamaño del globo ocular de una cabra, ON, y la estructura adyacente (cavidad orbitaria y nasal, base del cráneo, etc.) es similar al de un humano basado en la tomografía computarizada del ^cráneo9. Como tal, el modelo de cabra brinda la oportunidad de evaluar y refinar dispositivos terapéuticos o procedimientos quirúrgicos antes de su uso en humanos. El macaco rhesus, como primate no humano (NHP), tiene un sistema visual único similar al humano que no existe en otras ^{especies10,11}. Además, las respuestas fisiopatológicas a las lesiones y tratamientos en la NHP son muy similares a las de los seres ^humanos12.

Las pruebas in vivo para evaluar longitudinalmente la estructura y función del ON y el RGC son importantes en estudios con animales grandes. El electrorretinograma de patrón (PERG) se ha utilizado para evaluar la función RGC. El potencial evocado visual flash (FVEP) refleja la integridad de la vía retino-geniculo-cortical en el sistema visual. Así, PERG combinado con FVEP puede reflejar la función ON9,13,14 . La tomografía de coherencia óptica retiniana (OCT) puede mostrar la estructura retiniana con alta resolución temporal y espacial, lo que permite medir el grosor del complejo ganglionar retiniano (CCG)^9,15. Para los exámenes electrofisiológicos en este estudio, el monitoreo de los signos vitales (tasa de calor, tasa de ruptura, presión arterial) y el nivel de saturación de oxígeno (SpO2) antes de las pruebas son cruciales ya que estos parámetros tienen un impacto potente en el flujo sanguíneo ocular y, por lo tanto, en la función del sistema visual. Sin embargo, no monitoreamos los signos vitales al realizar imágenes de retina octianas en aras de la simplicidad. Según nuestro estudio ^anterior9, el grosor del CCG medido por imágenes retinianas octeales es bastante estable, con un coeficiente de variación entre sesiones cercano al 3%. Estas pruebas in vivo en cabra y macaco rhesus han sido descritas en detalle en nuestro estudio ^anterior9. Aquí presentamos estos métodos para ayudar a aumentar la transparencia experimental y la reproducibilidad.

Protocol

Los experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con las directrices de ARRIVE y la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y se adhieren a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad Médica de Wenzhou (WMU) y joinn Laboratory (Suzhou). Los machos de cabras Saanen, de 4 a 6 meses de edad con un peso de 19-23 kg, fueron alojados en las instalaciones de animales de la UMM. Los macacos Rhesus machos, d…

Representative Results

La Figura 1A muestra resultados representativos de FVEP en cabra. Aunque las formas de onda en la misma intensidad de flash tienen una similitud relativa, todavía recomendamos examinar las formas de onda dos veces. Las ondas electromagnéticas generadas por dispositivos electrónicos interferirán con las señales eléctricas recogidas, lo que resultará en un alto ruido de referencia y una mala repetibilidad de la forma de onda. Por lo tanto, se recomienda asegurarse de que no haya disposi…

Discussion

En este estudio, presentamos un protocolo de VEP, PERG y OCT en cabra y macaco rhesus. Estos métodos in vivo se pueden aplicar en modelos animales grandes de diversas neuropatías ópticas, como glaucoma, neuropatía óptica isquémica o traumática y neuritis ^óptica9.

PvEP es más estable y sensible que ^FVEP17; sin embargo, no se puede obtener en la ^cabra9. Como tal, FVEP se realiza en cabra y PVEP se realiza e…

Materials

47.6 x 26.8 cm monitors	DELL Inc.	E2216HV	The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube	Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd	PVC 6.0	ensure the airway
alligator clip
atropine	Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd.		reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	2300 La Chaux-De-Fonds	ERG recording
eye speculum	Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd	ZYD020	open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system	Heidelberg Engineering		OCT system
Imaging			(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22	isoflurane anesthesia
male Saanen goats	Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China)		The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	U51-426-G-D	use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously	BD shanghai Medical Device Co., Ltd	383019	intravenous access for atropine and propofol
propofol	Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd.		induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device	Gotec Co., Ltd	GT-2008V-III	use for FVEP & PERG
xylazine	Huamu Animal Health Products Co., Ltd.		xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50	Virbac		induce Isoflurane anesthesia in monkey