In vivo Métodos para avaliar a função e estrutura do gânglio de gânglios da retina e da estrutura em animais grandes

Summary

Aqui demostramos vários testes in vivo (flash visual evocado potencial, eletroretinograma padrão e tomografia de coerência óptica) em cabra e macaque rhesus para entender a estrutura e função do nervo óptico e seus neurônios.

Abstract

O nervo óptico coleta sinais de axônios das células gânglios da retina e transmite sinal visual para o cérebro. Grandes modelos animais de lesão do nervo óptico são essenciais para traduzir novas estratégias terapêuticas desde modelos de roedores até aplicação clínica devido às suas semelhanças mais próximas com os humanos em tamanho e anatomia. Aqui descrevemos alguns métodos in vivo para avaliar a função e estrutura das células gânglios da retina (RGCs) e nervo óptico (ON) em animais de grande porte, incluindo potencial visual evocado (VEP), eletroretinograma padrão (PERG) e tomografia de coerência óptica (OUT). Tanto o primata de cabra quanto o não-humano foram empregados neste estudo. Ao apresentar esses métodos in vivo passo a passo, esperamos aumentar a reprodutibilidade experimental entre diferentes laboratórios e facilitar o uso de grandes modelos animais de neuropatias ópticas.

Introduction

O nervo óptico (ON), que consiste em axônios das células gânglios da retina (RGC), transmite sinal visual da retina para o cérebro. Doenças on, como glaucoma, neuropatia óptica traumática ou isquêmica, muitas vezes causaram degeneração irreversível on/RGC e perda visual devastadora. Embora existam atualmente muitos avanços na regeneração ON e na proteção do RGC em modelos de roedores1,2,3,4,5,6, os tratamentos clínicos para a maioria das doenças ON permaneceram essencialmente os mesmos ao longo do último meio século com resultados insatisfatórios7,8 . Para preencher a lacuna entre a pesquisa básica e a prática clínica, estudos translacionais utilizando um grande modelo animal de doenças ON são muitas vezes necessários e benéficos devido à sua semelhança anatômica mais próxima com os humanos do que os modelos de roedores.

Os macaques de cabra e rhesus são duas grandes espécies animais usadas em nosso laboratório para modelar a doença ON humana. O tamanho do globo ocular de uma cabra, ON, e a estrutura adjacente (cavidade orbital e nasal, base do crânio, etc.) é semelhante ao de um humano baseado na tomografia do crânio ⁹. Como tal, o modelo de cabra oferece uma oportunidade de avaliar e refinar dispositivos terapêuticos ou procedimentos cirúrgicos antes do uso em humanos. O macaque rhesus, como primata não humano (NHP), tem um sistema visual único semelhante ao humano que não existe em outras ^{espécies10,11}. Além disso, as respostas fisiopatológicas a lesões e tratamentos em NHP são muito semelhantes às dos seres ^humanos12.

Testes in vivo para avaliar a estrutura e função on e RGC longitudinalmente são importantes em grandes estudos em animais. O eletroretinograma padrão (PERG) tem sido usado para avaliar a função RGC. O potencial evocado visual flash (FVEP) reflete a integridade da via retino-geniculo-cortical no sistema visual. Assim, o PERG combinado com o FVEP pode refletir a função ON9,13,14 . A tomografia de coerência óptica da retina (OCT) pode mostrar a estrutura da retina com alta resolução temporal e espacial, o que permite a medição da espessura do complexo gânglio da retina (GCC)^9,15. Para exames eletrofisiológicos neste estudo, o monitoramento de sinais vitais (taxa de calor, taxa de quebra, pressão arterial) e nível de saturação de oxigênio (SpO2) antes dos testes são cruciais, pois esses parâmetros têm impactos potentes no fluxo sanguíneo ocular e, portanto, na função do sistema visual. No entanto, não monitoramos os sinais vitais ao realizar imagens de retina OCT por uma questão de simplicidade. De acordo com nosso estudo ^anterior9, a espessura do GCC medida pela imagem da retina OCT é bastante estável, com coeficiente inter-sessão de variação próximo a 3%. Estes testes in vivo em cabra e rhesus macaque foram descritos em detalhes em nosso estudo ^anterior9. Aqui apresentamos esses métodos para ajudar a aumentar a transparência experimental e a reprodutibilidade.

Protocol

Os experimentos foram realizados estritamente de acordo com as diretrizes da ARRIVE e o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório, e seguem os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na Universidade Médica de Wenzhou (WMU) e pelo Laboratório Joinn (Suzhou). As cabras Saanen machos, com idades entre 4 e 6 meses com peso de 19 a 23 kg, estavam alojadas na instalação de animais da OMH. Os macaques Rhesus machos, com idades entre 5 e 6 ano…

Representative Results

Figura 1A mostra resultados representativos da FVEP em cabra. Embora as formas de onda na mesma intensidade flash tenham relativa semelhança, ainda recomendamos examinar as formas de onda duas vezes. Ondas eletromagnéticas geradas por dispositivos eletrônicos interferirão com os sinais elétricos coletados, resultando em alto ruído de linha de base e baixa repetibilidade da forma de onda. Portanto, recomenda-se garantir que não haja dispositivos eletrônicos redundantes conectados ao a…

Discussion

Neste estudo, apresentamos um protocolo de VEP, PERG e OCT em cabra e rhesus macaque. Esses métodos in vivo podem ser aplicados em grandes modelos animais de várias neuropatias ópticas, como glaucoma, neuropatia isquêmica ou óptica traumática e neurite ^óptica9.

PvEP é mais estável e sensível que o ^FVEP17; no entanto, não pode ser provocado em ^cabra9. Como tal, a FVEP é realizada em cabra e pvep é real…

Materials

47.6 x 26.8 cm monitors	DELL Inc.	E2216HV	The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube	Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd	PVC 6.0	ensure the airway
alligator clip
atropine	Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd.		reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	2300 La Chaux-De-Fonds	ERG recording
eye speculum	Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd	ZYD020	open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system	Heidelberg Engineering		OCT system
Imaging			(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22	isoflurane anesthesia
male Saanen goats	Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China)		The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	U51-426-G-D	use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously	BD shanghai Medical Device Co., Ltd	383019	intravenous access for atropine and propofol
propofol	Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd.		induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device	Gotec Co., Ltd	GT-2008V-III	use for FVEP & PERG
xylazine	Huamu Animal Health Products Co., Ltd.		xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50	Virbac		induce Isoflurane anesthesia in monkey