Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen
Summary
Ein Hochdurchsatzprotokoll für die Oberflächensterilisation von Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) -Samen wird bereitgestellt, das die Liquid-Handling-Schritte mit einer einfachen Absaugvorrichtung, die mit einer Vakuumpumpe konstruiert ist, optimiert. Hunderte von Samenproben können an einem Tag oberflächensterilisiert werden.
Abstract
Arabidopsis ist bei weitem die Pflanzenmodellart, die am häufigsten für funktionelle Studien verwendet wird. Die Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen ist ein grundlegender Schritt, der zu diesem Zweck erforderlich ist. Daher ist es von größter Bedeutung, Arabidopsis-Samenoberflächensterilisationsmethoden mit hohem Durchsatz zu etablieren, um Dutzende bis Hunderte von Proben (z. B. transgene Linien, Ökotypen oder Mutanten) gleichzeitig zu verarbeiten. In dieser Studie wird eine Saatgutoberflächensterilisationsmethode vorgestellt, die auf der effizienten Eliminierung von Flüssigkeit in Röhrchen mit einer selbstgebauten Absaugvorrichtung basiert, die aus einer herkömmlichen Vakuumpumpe besteht. Durch die drastische Reduzierung der arbeitsintensiven Hands-on-Zeit mit dieser Methode ist die Handhabung von mehreren hundert Proben an einem Tag mit wenig Aufwand möglich. Reihen-Zeitverlaufsanalysen zeigten ferner einen hochflexiblen Zeitbereich der Oberflächensterilisation durch Aufrechterhaltung hoher Keimraten. Diese Methode könnte leicht für die Oberflächensterilisation anderer Arten von kleinen Samen mit einfacher Anpassung der Saugvorrichtung an die Samengröße und die gewünschte Geschwindigkeit zur Beseitigung der Flüssigkeit angepasst werden.
Introduction
Arabidopsis ist eine diploide Pflanzenart aus der Familie der Brassicaceae. Sein relativ kurzer Lebenszyklus (zwei Monate pro Generation unter langen Wachstumsbedingungen), die geringe Pflanzengröße und die Selbstbestäubung mit der Produktion von Hunderten von Samen pro Pflanze haben es zur ersten grundlegenden Pflanzenmodellartgemacht 1,2. Darüber hinaus wurde sein Genom vollständig sequenziert3,umfangreiche reverse genetische Werkzeuge (gesättigte T-DNA, Transposon und chemisch mutagene Populationen) sind verfügbar4,5,6, und eine effektive Agrobacterium-vermittelteTransformation ist gut etabliert, um genügend transgene Linien für weitere nachgelagerte Arbeiten zu erhalten7 . So wurden in den letzten zwei Jahrzehnten große Fortschritte erzielt, indem Arabidopsis als Modellart verwendet wurde, um verschiedene Aspekte der Pflanzenbiologie auf molekularer Ebene zu sezieren, einschließlich natürlicher, genetischer und phänotypischer Variationen8,9.
Um Gene von Interesse an Arabidopsis funktionell zu charakterisieren, ist die Sterilisation der Samenoberfläche zur Beseitigung von Pilz- und Bakterienverunreinigungen die Voraussetzung für viele nachgeschaltete Protokolle, die axenische Kulturen erfordern. Genetische Transformation für die Überexpression10, Knock-Down (RNA-I11) oder Knock-Out (Genome Editing12,13) der Genfunktion, subzelluläre Lokalisation14, Promotoraktivität15,16, Protein-Protein17 und Protein-DNA-Interaktion18, um nur die häufigsten Anwendungen zu nennen, erfordern alle einen Samenoberflächen-Sterilisationsschritt. So spielt die Samenoberflächensterilisation trotz ihrer relativen Einfachheit in vielen Funktionsanalysen eine grundlegende Rolle.
Bisher wurden zwei Hauptkategorien von Saatgutoberflächensterilisationsverfahren entwickelt, die entweder auf der Gas- oder auf der Flüssigphasensterilisationbasieren 19. Während der Durchsatz der Gasphasen-Seed-Oberflächensterilisation mittel bis hoch ist, hat die Verwendung des gefährlichen ReagenzChlorgases als Oberflächensterilisationsmittel seine breite Anwendung behindert. Methoden, die auf der Flüssigphasensterilisation basieren, beruhen im Gegenteil auf milderen Chemikalien wie Ethanol und Bleichlösungen für die Oberflächensterilisation und werden häufiger verwendet, obwohl sie von Natur aus einen geringeren Durchsatz haben als die Chlorbegasung. Im Allgemeinen werden zwei verschiedene Methoden verwendet, die flüssige Reagenzien verwenden. Eine weitgehend verwendete Methode basiert auf dem Waschen mit Ethanol und Bleichmittel in unterschiedlichen Konzentrationen für unterschiedliche Zeitdauer20,21. Eine andere Methode basiert auf der Anwendung von Bleichmittel nur21,22. Beide Methoden werden hauptsächlich für die kleinräumige Sterilisation von Saatgutoberflächen angewendet. In vielen Experimenten ist es jedoch notwendig, viele transgene Arabidopsis-Linien, die von einer Transformation15,23 abgeleitetsind,zu screenen oder parallel viele transgene Linien zu screenen, die aus verschiedenen Transformationen erzeugt wurden24,25. Nach unserem besten Wissen wurde keine flüssigkeitsbasierte Methode zur Hochdurchsatz-Samenoberflächensterilisation veröffentlicht, die, wenn auch wenig erkannt, einen wichtigen Engpass für funktionelle Genomik-Ansätze darstellt. Daher ist die Entwicklung sicherer, robuster und Hochdurchsatzmethoden für die Sterilisation von Saatgutoberflächen ein notwendiger und kritischer Schritt für den Erfolg der funktionellen Charakterisierung vieler Gene auf einmal.
Zu diesem Zweck wird in der aktuellen Studie eine verbesserte Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen vorgestellt. Diese Methode ist sicher, kostengünstig, äußerst robust und mit hohem Durchsatz ausgestattet und ermöglicht die Handhabung von 96 unabhängigen Linien innerhalb einer Stunde vom Beginn der Samenoberflächensterilisation bis zum Ende der Saatgutaussaat in Petrischalen. Die demonstrierte Methode stützt sich auf weit verbreitete, grundlegende Laborinstrumente wie eine Vakuumpumpe, Verbrauchsglaswaren und Kunststoffwaren. Diese verbesserte Methode bietet der wissenschaftlichen Gemeinschaft einen sicheren, einfachen und erschwinglichen Ansatz zur Rationalisierung der Samenoberflächensterilisation mit einem Durchsatz, der für moderne funktionelle Genomikansätze bei Arabidopsis und anderen Nicht-Modellpflanzenarten geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Sterilisation von Samen ist der grundlegende Schritt für funktionelle Studien bei Arabidopsis. Obwohl es häufig für viele verschiedene Zwecke durchgeführt wird, sind begrenzte Studien zur Hochdurchsatz-Samenoberflächensterilisation bei Arabidopsis verfügbar.
Bisher ist eine der Methoden mit dem höchsten Durchsatz die Verwendung von Chlorgas, das durch Mischen von Bleichmittel mit konzentriertem HCl erzeugt wird. Obwohl diese Methode nur eine begrenzte praktische Zeit erfordert, verw…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Autonomen Provinz Trient durch eine Kernfinanzierung der Ecogenomics-Gruppe der Fondazione E. Mach finanziert.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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