Metodo ad alta produttività, robusto e altamente flessibile nel tempo per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis
Summary
Viene fornito un protocollo ad alto rendimento per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), ottimizzando le fasi di movimentazione del liquido con un semplice dispositivo di aspirazione costruito con una pompa per vuoto. Centinaia di campioni di semi possono essere sterilizzati in superficie in un giorno.
Abstract
Arabidopsis è di gran lunga la specie modello vegetale più utilizzata per gli studi funzionali. La sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis è un passo fondamentale in questa direzione. Pertanto, è fondamentale stabilire metodi di sterilizzazione superficiale dei semi arabidopsis ad alto rendimento per gestire da decine a centinaia di campioni (ad esempio, linee transgeniche, ecotipi o mutanti) contemporaneamente. In questo studio viene presentato un metodo di sterilizzazione della superficie dei semi basato sull’eliminazione efficiente del liquido nei tubi con un dispositivo di aspirazione fatto in casa costruito da una comune pompa per vuoto. Riducendo drasticamente il tempo di hands-on ad alta intensità di lavoro con questo metodo, è possibile gestire diverse centinaia di campioni in un giorno con poco sforzo. Le analisi del decorso temporale in serie hanno inoltre indicato un intervallo di tempo altamente flessibile di sterilizzazione superficiale mantenendo alti tassi di germinazione. Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la sterilizzazione superficiale di altri tipi di piccoli semi con una semplice personalizzazione del dispositivo di aspirazione in base alle dimensioni del seme e alla velocità desiderata per eliminare il liquido.
Introduction
Arabidopsis è una specie vegetale diploide appartenente alla famiglia delle Brassicaceae. Il suo ciclo di vita relativamente breve (due mesi per generazione in condizioni di crescita di lunga giornata), le piccole dimensioni delle piante e l’autoimpollinazione con la produzione di centinaia di semi per pianta ne hanno fatto la prima specie modello vegetale fondamentale1,2. Inoltre, il suo genoma è stato completamente sequenziato3, ampi strumenti di genetica inversa (T-DNA saturo, trasposone e popolazioni chimicamente mutagenizzate) sono disponibili4,5,6e l’efficace trasformazione mediata da Agrobacteriumè ben consolidata per ottenere linee transgeniche sufficienti per ulteriori lavori a valle7 . Così, negli ultimi due decenni, sono stati raggiunti grandi progressi utilizzando Arabidopsis come specie modello per sezionare diversi aspetti della biologia vegetale a livello molecolare, tra cui la variazione naturale, genetica e fenotipica8,9.
Per caratterizzare funzionalmente i geni di interesse in Arabidopsis, la sterilizzazione della superficie dei semi per eliminare i contaminanti fungini e batterici è il passo prerequisito per molti protocolli a valle che richiedono colture axeniche. La trasformazione genetica per la sovraespressione10,knock-down (RNA-I11)o knock-out (genome editing12,13)della funzione genica, localizzazione subcellulare14,attività promotore15,16,proteina-proteina17 e interazione proteina-DNA18,per citare solo le applicazioni più comuni, richiedono tutte una fase di sterilizzazione della superficie del seme. Pertanto, nonostante la sua relativa semplicità, la sterilizzazione della superficie dei semi svolge un ruolo fondamentale in molte analisi funzionali.
Finora, sono state sviluppate due principali categorie di metodi di sterilizzazione della superficie delle sementi basati sulla sterilizzazione in fase gassosa o liquida19. Mentre la produttività della sterilizzazione superficiale dei semi in fase gassosa è medio-alta, l’utilizzo del pericoloso gas cloro reagente come agente di sterilizzazione superficiale ha ostacolato la sua ampia applicazione. I metodi basati sulla sterilizzazione in fase liquida, al contrario, si basano su sostanze chimiche più miti come etanolo e soluzioni di candeggina per la sterilizzazione superficiale e sono più ampiamente utilizzati nonostante abbiano una produttività intrinsecamente inferiore rispetto alla fumigazione del cloro. In generale, due diversi metodi che utilizzano reagenti liquidi sono comunemente usati. Un metodo ampiamente utilizzato si basa sul lavaggio con etanolo e candeggina a diverse concentrazioni per diversa durata di tempo20,21. Un altro metodo si basa sull’applicazione di candeggina solo21,22. Entrambi i metodi sono applicati principalmente per la sterilizzazione superficiale di semi su piccola scala. Tuttavia, in molti esperimenti, è necessario vagliare molte linee transgeniche di Arabidopsis derivate da una trasformazione15,23 o schermare in parallelo molte linee transgeniche generate da diverse trasformazioni24,25. Per quanto ne sappiamo, non è stato pubblicato alcun metodo a base liquida per la sterilizzazione superficiale dei semi ad alto rendimento, che costituisce, sebbene poco riconosciuto, un importante collo di bottiglia per gli approcci di genomica funzionale. Pertanto, lo sviluppo di metodi sicuri, robusti e ad alto rendimento per la sterilizzazione della superficie dei semi è un passo necessario e critico verso il successo della caratterizzazione funzionale di molti geni contemporaneamente.
A tal fine, nel presente studio, viene presentato un metodo migliorato per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis. Questo metodo è sicuro, a basso costo, altamente robusto e ad alta produttività, consentendo di gestire 96 linee indipendenti entro un’ora dall’inizio della sterilizzazione della superficie del seme fino alla fine della semina in piastre di Petri. Il metodo dimostrato si basa su strumentazione di laboratorio di base ampiamente disponibile come una pompa per vuoto, vetreria consumabile e articoli in plastica. Questo metodo migliorato fornisce alla comunità scientifica un approccio sicuro, semplice e conveniente per semplificare la sterilizzazione della superficie dei semi con un throughput adeguato ai moderni approcci di genomica funzionale in Arabidopsis e altre specie vegetali non modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sterilizzazione dei semi è il passo fondamentale per gli studi funzionali in Arabidopsis. Sebbene sia spesso effettuato per molti scopi diversi, sono disponibili studi limitati sulla sterilizzazione superficiale dei semi ad alto rendimento in Arabidopsis.
Finora, uno dei metodi con il più alto rendimento è l’utilizzo di gas di cloro generato mescolando candeggina con HCl concentrato. Sebbene questo metodo richieda un tempo pratico limitato, utilizza un gas altamente tossico per gli esser…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dalla Provincia Autonoma di Trento attraverso il core funding del gruppo Ecogenomics della Fondazione E. Mach.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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