Método de alta produtividade, robusto e altamente flexível para esterilização superficial de sementes arabidopsis
Summary
É fornecido um protocolo de alta produtividade para a esterilização superficial de sementes arabidopsisthaliana (Arabidopsis), otimizando as etapas de manuseio líquido com um simples dispositivo de sucção construído com uma bomba de vácuo. Centenas de amostras de sementes podem ser esterilizadas em um dia.
Abstract
Arabidopsis é de longe a espécie modelo vegetal mais utilizada para estudos funcionais. A esterilização superficial das sementes arabidopsis é um passo fundamental necessário para este fim. Assim, é primordial estabelecer métodos de esterilização superficial de sementes arabidopsis de alto rendimento para lidar com dezenas a centenas de amostras (por exemplo, linhas transgênicas, ecotipos ou mutantes) ao mesmo tempo. Um método de esterilização de superfície de sementes baseado na eliminação eficiente de líquido em tubos com um dispositivo de sucção caseiro construído a partir de uma bomba de vácuo comum é apresentado neste estudo. Reduzindo drasticamente o tempo prático com este método manuseando várias centenas de amostras em um dia é possível com pouco esforço. As análises do curso-período da série indicaram ainda uma faixa de tempo altamente flexível de esterilização superficial, mantendo altas taxas de germinação. Este método poderia ser facilmente adaptado para esterilização superficial de outros tipos de pequenas sementes com simples personalização do dispositivo de sucção de acordo com o tamanho da semente, e a velocidade desejada para eliminar o líquido.
Introduction
Arabidopsis é uma espécie de planta diploide pertencente à família Brassicaceae. Seu ciclo de vida relativamente curto (dois meses por geração em condições de crescimento prolongado), tamanho de plantas pequenos e auto-polinização com a produção de centenas de sementes por planta fizeram dela a primeira espécie fundamental do modelo vegetal1,2. Além disso, seu genoma foi totalmente sequenciado3, extensas ferramentas genéticas reversas (T-DNA saturado, transposon e populações quimicamente mutagenizadas) estão disponíveis4,5,6, e a transformação eficaz agrobacterium-mediada é bem estabelecida para obter linhas transgênicas suficientes para mais trabalho a jusante7 . Assim, nas últimas duas décadas, grandes avanços foram alcançados utilizando a Arabidopsis como espécie modelo para dissecar diversos aspectos da biologia vegetal no nível molecular, incluindo variação natural, genética e fenotípica8,9.
Para caracterizar funcionalmente genes de interesse na Arabidopsis, a esterilização da superfície das sementes para eliminar contaminantes fúngicos e bacterianos é o passo pré-requisito para muitos protocolos a jusante que requerem culturas axeônicas. Transformação genética para a superexpressão10, knock-down (RNA-I11) ou knock-out (edição de genoma12,13) da função genética, localização subcelular14,atividade promotora15,16, proteína-proteína17 e interação proteína-DNA18, para citar apenas as aplicações mais comuns, todas necessitam de uma etapa de esterilização superficial de sementes. Assim, apesar de sua relativa simplicidade, a esterilização da superfície das sementes desempenha um papel fundamental em muitas análises funcionais.
Até agora, duas grandes categorias de métodos de esterilização de superfície de sementes foram desenvolvidas com base no gás ou na esterilização em fase líquida19. Embora o throughput de esterilização da superfície de sementes em fase de gás seja médio a alto, o uso do gás de cloro de reagente perigoso como agente de esterilização superficial tem dificultado sua ampla aplicação. Métodos baseados na esterilização em fase líquida, pelo contrário, dependem de produtos químicos mais leves, como etanol e soluções alvejantes para esterilização superficial, e são mais amplamente utilizados, apesar de terem um rendimento inerentemente menor do que a fumigação de cloro. Em geral, dois métodos diferentes que usam reagentes líquidos são comumente utilizados. Um método amplamente utilizado é baseado na lavagem com etanol e alvejante em diferentes concentrações por diferentes períodos detempo 20,21. Outro método baseia-se na aplicação de alvejanteapenas 21,22. Ambos os métodos são aplicados principalmente para esterilização de superfície de sementes em pequena escala. No entanto, em muitos experimentos, é necessário telar muitas linhas transgênicas arabidopsis derivadas de uma transformação15,23 ou tela em paralelo muitas linhas transgênicas geradas a partir de diferentes transformações24,25. Pelo que sabemos, nenhum método baseado em líquido para esterilização de superfície de sementes de alta produtividade foi publicado, o que constitui, embora pouco reconhecido, um importante gargalo para abordagens de genômica funcional. Portanto, desenvolver métodos seguros, robustos e de alta produtividade para a esterilização da superfície de sementes é um passo necessário e crítico para o sucesso da caracterização funcional de muitos genes ao mesmo tempo.
Para isso, no presente estudo, é apresentado um método aprimorado para esterilização superficial de sementes arabidopsis. Este método é seguro, de baixo custo, altamente robusto e de alta produtividade, permitindo o manuseio de 96 linhas independentes dentro de uma hora desde o início da esterilização da superfície das sementes até o fim da semeadura em placas de Petri. O método demonstrado conta com instrumentação de laboratório amplamente disponível, como uma bomba de vácuo, vidros consumíveis e utensílios plásticos. Este método aprimorado fornece à comunidade científica uma abordagem segura, simples e acessível para simplificar a esterilização da superfície das sementes com uma throughput adequada às abordagens modernas de genômica funcional em Arabidopsis e outras espécies vegetais não modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A esterilização de sementes é o passo fundamental para estudos funcionais em Arabidopsis. Embora seja frequentemente realizada para muitos propósitos diferentes, estudos limitados sobre esterilização de superfície de sementes de alta produtividade em Arabidopsis estão disponíveis.
Até agora, um dos métodos com maior rendimento é o uso de gás cloro gerado pela mistura de alvejante com HCl concentrado. Embora este método exija tempo prático limitado, ele usa um gás altamente tóx…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pela Província Autônoma de Trento através do financiamento central do grupo de Ecogenômica de Fondazione E. Mach.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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