Summary
Мы спроектировали и построили мобильную лабораторию для измерения частоты дыхания в изолированных митохондриях диких животных, отловленных в полевых условиях. В этой статье мы опишем конструкцию и оснащение мобильной митохондриальной лаборатории и связанные с ней лабораторные протоколы.
Abstract
Митохондриальная энергетика является центральной темой в биохимии и физиологии животных, и исследователи используют митохондриальное дыхание в качестве показателя для изучения метаболических способностей. Для получения показателей митохондриального дыхания необходимо использовать свежие биологические образцы, и вся лабораторная процедура должна быть завершена в течение примерно 2 часов. Кроме того, для проведения этих лабораторных анализов требуется несколько единиц специализированного оборудования. Это создает проблему для измерения митохондриального дыхания в тканях диких животных, живущих вдали от физиологических лабораторий, поскольку живая ткань не может сохраняться в течение длительного времени после сбора в полевых условиях. Кроме того, транспортировка живых животных на большие расстояния вызывает стресс, который может изменить энергетику митохондрий.
Эта рукопись знакомит с MitoMobile Обернского университета (AU), мобильной лабораторией митохондриальной физиологии, которую можно взять с собой в полевых условиях и использовать на месте для измерения митохондриального метаболизма в тканях, полученных от диких животных. Представлены основные возможности мобильной лаборатории и пошаговые методы измерения частоты изолированного митохондриального дыхания. Кроме того, представленные данные подтверждают успешность оснащения мобильной лаборатории митохондриальной физиологии и проведения измерений митохондриального дыхания. Новизна мобильной лаборатории заключается в возможности выезжать в поле и проводить митохондриальные измерения на тканях животных, отловленных на месте.
Introduction
На сегодняшний день исследования, предназначенные для измерения митохондриальной энергии, были ограничены лабораторными животными или животными, пойманными рядом с установленными физиологическими лабораториями, что не позволяло ученым проводить митохондриальные биоэнергетические исследования в тканях, собранных у животных во время таких видов деятельности, как миграция, ныряние и спячка 1,2,3,4,5,6 . В то время как многие исследователи успешно измеряли базальную и пиковую скорость метаболизма и суточные энергетические затраты диких животных 7,8, возможности исследователей по измерению производительности митохондрий остаются ограниченными (см. 1,4,9). Отчасти это связано с потребностью в свежей ткани для изоляции митохондрий и лабораторном оборудовании для проведения выделения в течение примерно 2 часов после получения свежей ткани. После того, как митохондрии были изолированы, измерения митохондриального дыхания также должны быть завершены в течение ~1 часа.
Изолированные митохондриальные дыхательные циклы обычно измеряются путем измерения концентрации кислорода в герметичном контейнере, подключенном к электроду Кларка. Теория, лежащая в основе этого метода, основана на фундаментальном наблюдении, что кислород является последним акцептором митохондриального дыхания во время окислительного фосфорилирования. Поэтому, поскольку концентрация кислорода падает во время эксперимента, предполагается, что происходит выработка аденозинтрифосфата (АТФ)10. Потребляемый кислород является показателем выработанной АТФ. Исследователи могут создать определенные экспериментальные условия, используя различные субстраты, и инициировать дыхание, стимулированное аденозиндифосфатом (АДФ) (состояние 3), добавив в камеру заданное количество АДФ. После фосфорилирования экзогенного АДФ в АТФ скорость потребления кислорода снижается, и состояние 4 достигается и может быть измерено. Кроме того, добавление специфических ингибиторов позволяет получить информацию о негерметичном дыхании и несвязанном дыхании10. Отношение состояния 3 к состоянию 4 определяет коэффициент дыхательного контроля (RCR), который является показателем общей митохондриальной связи10,11. Более низкие значения RCR указывают на общую митохондриальную дисфункцию, в то время как более высокие значения RCR предполагают большую степень митохондриальной связи10.
Как указывалось ранее, сбор биологического материала, выделение митохондрий и измерение частоты дыхания должны быть завершены в течение 2 ч после получения ткани. Чтобы выполнить эту задачу без транспортировки животных на большие расстояния в существующие лаборатории, была построена мобильная лаборатория митохондриальной физиологии, которую можно было бы доставить в полевые места, где эти данные могут быть собраны. Рекреационный автомобиль Jayco Redhawk 2018 года выпуска был преобразован в мобильную лабораторию молекулярной физиологии и назван MitoMobile Обернского университета (AU) (рис. 1A). Рекреационный автомобиль был выбран из-за встроенного холодильника, морозильной камеры, резервуара для хранения воды и сантехники, электричества от 12-вольтовых аккумуляторов, газового генератора, баллона с пропаном и системы самовыравнивания. Кроме того, рекреационное транспортное средство обеспечивает возможность ночевки в отдаленных местах для сбора данных. Передняя часть автомобиля не была переделана и обеспечивает управление и спальные места (рис. 1Б). Ранее установленные удобства в спальне (кровать, телевизор и шкаф) в задней части автомобиля и на плите были удалены.
Изготовленные на заказ стеллажи из нержавеющей стали и изготовленная на заказ кварцевая столешница, поддерживаемая алюминиевым каркасом 80/20, были установлены вместо туалетных принадлежностей и плиты (рис. 1C). Лабораторные столы обеспечивают достаточное пространство для сбора данных (рис. 1D). Учитывалось энергопотребление каждой единицы оборудования (т.е. охлаждаемой центрифуги, митохондриальных дыхательных камер, планшетов, компьютеров, гомогенизаторов, весов, портативной ультраморозильной камеры и других общелабораторных принадлежностей). Чтобы удовлетворить высокие требования центрифуги к напряжению и току, электрическая система была модернизирована до уровня авиационного оборудования. Внешний отсек в задней части автомобиля был преобразован в отсек для хранения жидкого азота, что соответствует рекомендациям Министерства транспорта США по хранению и транспортировке жидкого азота. Этот накопитель изготовлен из нержавеющей стали и имеет надлежащую вентиляцию, чтобы предотвратить утечку расширяющегося газообразного азота в салон автомобиля.
Чтобы подтвердить, что мобильная лаборатория может быть использована в митохондриальных биоэнергетических исследованиях, были выделены митохондрии и измерена скорость митохондриального дыхания скелетных мышц задних конечностей диких домовых мышей (Mus musculus). Поскольку Mus musculus является модельным организмом, скорость митохондриального дыхания этого вида хорошо известна12,13,14. Несмотря на то, что в предыдущих исследованиях была задокументирована изоляция митохондрий с помощью дифференциального центрифугирования15,16,17, ниже описан краткий обзор методов, используемых в мобильных методах митохондриальной физиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В следующих разделах описываются митохондриальные лабораторные методы. Все процедуры обращения с животными и сбора тканей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Обернского университета (#2019-3582).
1. Описание буферов, используемых для сбора данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти буферы могут быть приготовлены в стационарной лаборатории и перемещены в мобильную лабораторию перед экскурсией (если иное не указано ниже).
- Приготовьте буфер митохондриальной изоляции скелетных мышц с бычьим сывороточным альбумином (БСА), как показано в таблице 1.
- Растворяйте химические вещества в деионизированной воде (~ 90% объема), за исключением БСА, не содержащего жирных кислот. Поместите буфер в холодильник до тех пор, пока температура не станет 4 °C.
- Доведите раствор до рН 7,5, поддерживая температуру на уровне 4 °C.
- Добавьте БСА без жирных кислот и увеличьте объем до 100%. Раствор аликвотируют в конические пробирки по 50 мл. Храните этот раствор при температуре -20 °C до использования.
- Приготовьте митохондриальный изоляционный буфер скелетных мышц без БСА, как показано в таблице 1.
- Растворите химикаты в деионизированной воде (~ 90% объема). Поместите буфер в холодильник до тех пор, пока температура не станет 4 °C.
- Доведите раствор до рН 7,5, поддерживая температуру на уровне 4 °C.
- Увеличьте громкость до 100%. Раствор аликвотируют в конические пробирки по 50 мл. Храните этот раствор при температуре -20 °C до использования.
- Подготовьте буфер для ресуспензии скелетных мышц, как показано в таблице 1.
- Растворите химикаты в деионизированной воде (~ 90% объема). Поместите буфер в холодильник до тех пор, пока температура не станет 4 °C.
- Доведите раствор до рН 7,4 при поддержании температуры на уровне 4 °C.
- Увеличьте громкость до 100%. Раствор аликвотируют в конические пробирки по 50 мл. Храните этот раствор при температуре -20 °C до использования.
- Подготовьте буфер для дыхания скелетных мышц, как показано в таблице 2.
- Растворите химические вещества в деионизированной воде (~ 90% объема), за исключением БСА, не содержащего жирных кислот. Нагрейте буфер до температуры 37 °C.
- Доведите раствор до рН 7,0 при поддержании температуры на уровне 37 °C.
- Добавьте БСА без жирных кислот и увеличьте объем до 100%. Раствор аликвотируют в конические пробирки по 50 мл. Храните этот раствор при температуре -20 °C до использования.
- Подготовьте дыхательные субстраты, как показано в таблице 2.
- Убедитесь, что эти субстраты сделаны свежими в день сбора данных в 100 мМ Tris-HCl, pH 7,4. Хранить на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные значения предназначены для получения достаточно концентрированного раствора для поглощения митохондриями достаточного количества субстрата. Конечные концентрации субстратов составляют 2 мМ пирувата, 2 мМ малата, 10 мМ глутамата и 5 мМ сукцината.
- Убедитесь, что эти субстраты сделаны свежими в день сбора данных в 100 мМ Tris-HCl, pH 7,4. Хранить на льду до использования.
2. Выполнение митохондриальной изоляции (рис. 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения митохондриальной изоляции и митохондриального дыхания проводятся на лабораторном столе передвижной лаборатории, и все растворы должны храниться при температуре 4 °C, если не указано иное.
- Припаркуйте мобильную лабораторию на ровной поверхности. Включите генератор и выровняйте автомобиль. Выдвиньте горку и настройте оборудование.
- Разморозьте нужное количество буферов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на каждую мышцу требуется 30 мл буфера для изоляции скелетных мышц и 10 мл буфера для изоляции скелетных мышц без BSA. - Настройте и откалибруйте митохондриальные дыхательные камеры до желаемой температуры экспериментов и текущего барометрического давления в соответствии с инструкциями производителя. Конкретные камеры, используемые в экспериментах, см. в таблице материалов .
- Усыпить животное путем обезглавливания.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании для эвтаназии использовалась процедура обезглавливания. Некоторые газы, такие как углекислый газ и изофлуран, влияют на функцию митохондрий18,19,20; Эти эффекты следует учитывать при выборе наилучшего метода эвтаназии для каждого исследования. Какой метод должен быть выполнен для каждого исследования, будет определяться задаваемым научным вопросом. - Иссеките скелетные мышцы, быстро удалите жир и соединительную ткань, взвесьте и поместите мышцу в буфер для изоляции скелетных мышц с BSA (не менее 1/10 w/v) (например, 1 г скелетной мышцы на 10 мл буфера).
- Измельчите скелетные мышцы ножницами на льду.
- Переложите измельченную ткань в центрифужную пробирку объемом 50 мл, используя нарезанный наконечник пипетки объемом 5 мл. Гомогенизируйте его лезвием (см. Таблицу материалов) при мощности 50% в течение 5 с. Добавьте протеазу (5 мг/г влажной мышцы) и переваривайте в течение 7 мин, перемешивая раствор каждые 30 с. Завершите реакцию, добавив равный объем буфера изоляции с BSA.
- Центрифугируют гомогенат при 500 × г в течение 10 мин. Перелейте надосадочную жидкость через двухслойную марлю с помощью нарезанного наконечника пипетки объемом 5 мл в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Центрифугируют надосадочную жидкость при концентрации 3500 × г в течение 10 мин, чтобы получить осадок коричневой митохондриальной гранулы.
- Вылейте оставшуюся надосадочную жидкость. Добавьте в центрифужную пробирку такой же объем изоляционного буфера с BSA. Ресуспендируйте митохондриальную гранулу с помощью гибкого скребка (полицейского), осторожно отталкивая митохондриальную гранулу от стенок центрифужной пробирки. Центрифуга при 3 500 × г в течение 10 мин.
- Вылейте оставшуюся надосадочную жидкость. Добавьте такой же объем изоляционного буфера без BSA в центрифужную пробирку. Ресуспендируйте митохондриальную гранулу, осторожно отработав митохондриальную гранулу от стенок центрифужной пробирки чистым полицейским. Центрифуга при 3 500 × г в течение 10 мин.
- Сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте митохондриальную гранулу в буфере суспендирования, осторожно отработав митохондриальную гранулу от стенок центрифужной пробирки с помощью чистого полицейского.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера ресуспендирования будет зависеть от размера гранулы митохондрий. - Перенесите ресуспендированные митохондрии в гомогенизатор Dounce с отрезанным наконечником пипетки объемом 1 мл. Используя гомогенизатор Dounce, тщательно гомогенизируйте суспензию за 4-5 проходов.
- Поместите митохондриальную суспензию в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл с маркировкой, используя другой наконечник пипетки объемом 1 мл.
3. Измерение митохондриального дыхания (рис. 3)
- Сложные подложки I
- Добавьте в камеру 945 мкл дыхательного буфера. Убедитесь, что мешалка вращается, а буферная температура поддерживается на уровне 37 °C. Запустите запись сбора данных.
- После того, как концентрация кислорода стабилизируется, добавьте 20 мкл митохондрий и накройте камеру крышкой. В программном обеспечении обозначим, что митохондрии были добавлены в камеру.
- Добавьте в камеру отдельными шприцами 10 мкл 1 М глутамата, 10 мкл малата 200 мМ и 10 мкл пирувата 200 мМ и подождите, пока сигнал стабилизируется. В программном обеспечении обозначьте, что подложки были добавлены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти субстраты обычно используются для измерения углеводного дыхания. О других комбинациях субстратов, которые можно использовать для измерения жирового дыхания, см.21. - Добавьте 5 мкл АДФ отдельным шприцем и наблюдайте за быстрым потреблением кислорода (состояние 3). В программном обеспечении обозначьте, что был добавлен ADP.
ПРИМЕЧАНИЕ: После фосфорилирования добавленного АДФ скорость потребления кислорода выйдет на плато до состояния 4. - Через 4 минуты после сбора данных состояния 4 завершите запись. Сохраните файл данных.
- Субстраты Complex II
- Добавьте в камеру 963 мкл дыхательного буфера. Убедитесь, что мешалка вращается, а буферная температура поддерживается на уровне 37 °C. Запустите запись сбора данных.
- После того, как концентрация кислорода стабилизируется, добавьте 20 мкл митохондрий и накройте камеру крышкой. В программном обеспечении обозначим, что в раствор были добавлены митохондрии.
- Добавьте 2 мкл 4 мкг/мкл ротенона, а затем 10 мкл 500 мМ сукцината в камеру с помощью отдельных шприцев и подождите, пока сигнал стабилизируется. В программном обеспечении обозначьте, что подложки были добавлены.
- Добавьте 5 мкл АДФ с помощью отдельного шприца и наблюдайте за быстрым потреблением кислорода (состояние 3). В программном обеспечении обозначьте, что был добавлен ADP.
ПРИМЕЧАНИЕ: После фосфорилирования добавленного АДФ скорость потребления кислорода выйдет на плато до состояния 4. - Через 4 минуты после сбора данных состояния 4 завершите запись. Сохраните файл данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящей рукописи исследовалось митохондриальное дыхание Mus musculus дикого происхождения (n = 7, самец = 5, самка = 2; возраст = 1,30 ± 0,2 года) в мобильной лаборатории митохондриальной физиологии (рис. 1). Для измерения митохондриального дыхания скелетных мышц для изоляции митохондрий использовали всю заднюю конечность, т.е. аэробную и анаэробную мышцу (рис. 2). Примеры исходных данных митохондриального дыхания показаны на рисунке 3. На рисунках 3А и 3Б показано сложное И-управляемое митохондриальное дыхание. Крутой склон, наблюдаемый на рисунке 3А , представляет собой высокую максимальную частоту дыхания. Это значение, используемое для дальнейшего анализа данных. Успешное выделение митохондрий из скелетной мускулатуры задних конечностей наблюдается по резкому повороту и стабилизации нового наклона, что определяет состояние 4 (рис. 3Б).
Эти данные также могут быть интерпретированы как высокофункциональные митохондрии из-за резкого поворота к установлению состояния 4. Аналогичная картина наблюдается и для сложного митохондриального дыхания, управляемого II (рис. 3C и рис. 3D). На рисунках 3E, F показано, что митохондрии плохо функционируют, либо из-за физиологии митохондрий, либо из-за неудачного митохондриального дыхания. На рисунке 3Е показано сопряжение митохондрий для сложного I-управляемого митохондриального дыхания, как видно из поворота в состояние 4. Тем не менее, на рисунке 3F показано несвязанное митохондриальное дыхание комплекса II, что демонстрируется плоской линией после добавления АДФ, и отсутствие «поворота» для получения данных о состоянии 4. Эти данные позволяют предположить возможные проблемы при выделении митохондрий, которые обсуждаются ниже.
Численные значения состояния 3, состояния 4 и RCR как для комплекса I, так и для комплекса II этих животных можно найти на рисунке 4. Эти данные определяли путем измерения 30 с наибольшего крутого уклона после добавления АДФ для определения состояния 3 (рис. 3А, В) и измерения уклона после «поворота» в течение 1 мин для измерения состояния 4 (рис. 3Б, Г). После того, как эти значения были получены, данные были нормализованы к содержанию белка (с помощью анализаБрэдфорда 22). Используя нормализованные значения, RCR рассчитывали путем деления значения нормализованного состояния 3 на значение нормализованного состояния 4.
Рисунок 1: AU MitoMobile, мобильная лаборатория митохондриальной физиологии. (A) Внешняя сторона AU MitoMobile. (B) Внутренняя часть транспортного средства, смотрящая спереди, где не было произведено никаких изменений. (C) Задняя часть транспортного средства, показывающая установку скамеек, отсеков для хранения и центрифуги. (D) Настройка оборудования во время сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изоляция митохондрий и процедура измерения дыхания в скелетных мышцах. (1) Ткань отделяют от животного и помещают в буфер, где она (2) измельчается, гомогенизируется, обрабатывается протеазой и подвергается центрифугированию до тех пор, пока не будет получена митохондриальная гранула. (3) Митохондриальная гранула ресуспендирована, и получены данные о дыхании. (4) Данные о потреблении кислорода можно использовать для расчета состояния 3, состояния 4 и RCR. Аббревиатура: RCR = коэффициент контроля дыхания. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерения митохондриального дыхания с субстратами комплекса I и комплекса II. Потребление кислорода со сложными подложками I с выделением анализа уклона состояния 3 (А) и состояния 4 (В). Потребление кислорода со сложными подложками II с выделением анализа уклона состояния 3 (C) и состояния 4 (D). Субоптимальное митохондриальное дыхание можно наблюдать при сложном I-управляемом дыхании (E) и сложном II-управляемом дыхании (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Данные, собранные на домашних мышах (Mus musculus) в AU MitoMobile. Митохондриальную изоляцию и дыхание проводили с помощью процедуры, описанной здесь. Пируват, малат и глутамат использовали для определения скорости дыхания комплекса I. Сукцинат и ротенон использовали для измерения частоты дыхания II комплекса. (A) Состояние комплекса I 3 измерений, (B) состояние I состояния 4 измерения, (C) состояние I RCR, (D) состояние II состояния 3 измерения, (E) состояние комплекса II состояние 4 измерений и (F) комплекс II RCR. Аббревиатура: RCR = коэффициент контроля дыхания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Изолирующий буфер митохондрий для скелетных мышц | ||
| Реагент | с БСА, концентрация (мМ) | без БСА, концентрация (мМ) |
| KCl | 100 | 100 |
| Трис-HCl | 40 | 40 |
| Трис-Бейс | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| ЭГТА | 1 | 1 |
| СПС | 0.2 | 0.2 |
| Не содержит жирных кислот BSA | 0.15% | - |
| Изолированный митохондриальный буфер для ресуспензии скелетных мышц | ||
| Реагент | Концентрация (мМ) | |
| Маннитол | 220 | |
| Сахароза | 70 | |
| Трис-HCl | 10 | |
| ЭГТА | 1 | |
Таблица 1: Буферы изоляции митохондрий (с БСА и без него) и изолированный буфер митохондриальной ресуспензии для скелетных мышц.
| Дыхательный буфер | |
| Реагент | Концентрация (мМ) |
| KCl | 100 |
| ШВАБРЫ | 50 |
| КХ2РО4 | 10 |
| Глюкоза | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| ЭГТА | 1 |
| Не содержит жирных кислот BSA | 0.20% |
| Дыхательные субстраты | |
| Реагент | Концентрация (мМ) |
| Пируват | 200 |
| Малат | 200 |
| Сукцинат | 500 |
| АДП | 100 |
| Глутамат | 1000 |
Таблица 2: Дыхательный буфер и субстраты.
| Состояние 3 | Состояние 4 | РЦР | Изучать | Субстратов |
| 368,3±80,4 | 68,9±25,0 | 5,8±1,6 | 12 | 2 мМ пируват, 2 мМ малат |
| 241,8±22,5 | 28,9±3,2 | 8,3±1,9 | 23 | 5 мМ пирувата, 2 мМ малата |
| 285,7±36,5 | 81,9±2,9 | 3,5±1,0 | 23 | 10 мМ сукцинат, 4 мкМ ротенон |
| 493,4±105,4 | 61,3±9,6 | 8.2±2.2 | Текущее исследование | 2 мМ пирувата, 2 мМ малата, 10 мМ глутамата |
| 559,5±74,9 | 165,2±18,5 | 3,4±0,2 | Текущее исследование | 5 мМ сукцинат, 4 мкг/мкл ротенон |
Таблица 3: Сравнительные значения состояния 3, состояния 4 и RCR. Аббревиатура: RCR = коэффициент контроля дыхания. Значения состояния 3 и состояния 4 указаны в нмолях O2/мг белка/мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мобильная лаборатория митохондриальной физиологии позволяет исследователям изолировать митохондрии и измерять скорость митохондриального дыхания в течение 2 часов после забора ткани на удаленных полевых участках. Представленные здесь результаты позволяют предположить, что измерения митохондриального дыхания, выполненные в AU MitoMobile, сопоставимы с измерениями, выполненными в университетской исследовательской лаборатории. В частности, представленные здесь значения для состояний 3, 4 и RCR для Mus musculus дикого происхождения сопоставимы с ранее опубликованными результатами, полученными в той же и других лабораториях (табл. 3)12,23. Однако следует отметить, что из-за различных штаммов мышей и используемых методов прямое сравнение этих исследований невозможно. Эти результаты демонстрируют доказательство концепции измерения митохондриального дыхания в этой мобильной лаборатории митохондриальной физиологии.
Все химические вещества и материалы, необходимые для выделения митохондрий и дыхания, могут транспортироваться и храниться в передвижной лаборатории, что обеспечивает легкий доступ при постановке и проведении экспериментов. Кроме того, изолированные митохондрии, собранные в мобильной митохондриальной лаборатории, обеспечивают уникальный образец для выполнения других биохимических измерений, таких как выброс активных форм кислорода. Важно отметить, что замороженные митохондрии могут быть транспортированы в стационарную лабораторию для дополнительных биохимических измерений (например, активности ферментов в индивидуальной цепи переноса электронов). Примечательно, что выделение митохондрий с помощью центрифугирования не является единственным методом измерения митохондриального дыхания. Другие лаборатории провели успешные измерения митохондриального дыхания с помощью пермеабилизированных волокон. Несмотря на то, что данная рукопись не описывает этот метод (подробнее о пермеабилизированных волокнах см. 24,25,26,27,28), читателям важно отметить, что мобильная лаборатория митохондриальной физиологии также может содержать материалы, необходимые для этой процедуры. Пожалуйста, ознакомьтесь с другими отзывами о сильных и слабых сторонах каждого из этих методов25,29,30.
Несколько лабораторий, проводящих исследования в области митохондриальной биоэнергетики, опубликовали рекомендации по устранению неполадок, которые могут быть полезнычитателям 15,17. Для любого экспериментального проекта должна быть создана одна партия буферов для сбора всех данных. Использование буферов, изготовленных в разные дни, создает возможность для вариаций в решениях, влияющих на измерения митохондриального дыхания. Повреждение наружной митохондриальной мембраны произойдет в процессе изоляции; Тем не менее, надлежащее выполнение метода изоляции с помощью лабораторной подготовки может свести к минимуму ущерб, который естественным образом возникнет при этой процедуре29,31. В процессе выделения нефункционирующие или чрезмерно поврежденные митохондрии обозначаются белой пушистой митохондриальной гранулой, а не компактной коричневой гранулой. Нефункционирующие или поврежденные митохондрии могут быть вызваны чрезмерными оборотами во время гомогенизации лопастей, слишком долгой гомогенизацией, добавлением слишком большого количества протеазы или слишком долгим перевариванием, или слишком большим количеством ударов, используемых во время окончательной ресуспендации митохондрий.
Более того, выбор того, какую мышцу изолировать и сколько мышц использовать, повлияет на выход митохондрий. Например, у животного с более высокой плотностью митохондрий, такого как птица21, будет осаждено больше митохондрий по сравнению со смесью типов скелетных мышечных волокон задней конечности крысы. Это также изменит количество ткани, необходимой для успешной изоляции. Чем больше плотность митохондрий в ткани, тем меньше количество ткани, необходимое для успешного выделения. Исследователи также должны учитывать объем раствора маннита и сахарозы, добавляемого к конечным изолированным митохондриям. Более плотно упакованная митохондриальная гранула будет нуждаться в более высоком разведении, в то время как менее плотно упакованная митохондриальная гранула будет нуждаться в более низком разведении. Степень разведения будет зависеть от животного, окислительной природы выделяемой скелетной мышцы и от того, насколько плотно упакована митохондриальная гранула.
Наличие достаточного количества электроэнергии для поддержки всего оборудования, необходимого для сбора данных в мобильной лаборатории, может быть сложной задачей. Примечательно, что центрифуга с охлаждением потребляет большой ток во время работы (особенно на начальных этапах охлаждения). Поэтому следует обратить особое внимание на то, чтобы электрическая мощность транспортного средства соответствовала электрическим потребностям оборудования, необходимого для одновременной работы. Рекомендация, которая могла бы устранить это ограничение, заключается в добавлении большего количества источников питания (например, дополнительных батарей, дополнительных генераторов). Примечательно, что метод измерения митохондриального дыхания с помощью пермеабилизированных волокон не требует использования охлаждаемой центрифуги и также может обеспечить разрешение ограниченного источника энергии. При использовании передвижной лаборатории также следует учитывать условия окружающей среды и качество дорог. Мобильная лаборатория митохондриальной физиологии, о которой идет речь, успешно передвигалась по дорогам между штатами в ясную погоду. Грунтовые дороги с суровыми погодными условиями создадут большие трудности при доставке транспортного средства к интересующему месту. Хотя митохондриальная изоляция не является новым методом, ее использование в мобильной лаборатории обеспечивает уникальный способ количественной оценки митохондриальной энергии у свободноживущих животных. Это может иметь решающее значение для выяснения различий между лабораторными и дикими животными32,33,34. Кроме того, мобильная лаборатория митохондриальной физиологии позволяет исследователям изучать энергетические ограничения и энергетические экстремальные значения, встречающиеся у животных в естественном мире.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность Марку Нелмсу (Mark Nelms) и Джону Теннанту (John Tennant) с кафедры электротехники и вычислительной техники Инженерного колледжа Сэмюэля Гинна при Обернском университете за помощь в структурном и электрическом оснащении AU MitoMobile. Кроме того, авторы выражают признательность за финансирование оснащения AU MitoMobile и исследования в рамках гранта Президентской премии Обернского университета за междисциплинарные исследования (PAIR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
