Nachweis von Virus- und Speichelproteinen eines Zikadenvektors im pflanzlichen Wirt
Summary
Dieses Protokoll demonstriert, wie der pflanzliche Wirt verwendet werden kann, um Speichelproteine von Zikaden und pflanzliche virale Proteine zu detektieren, die von Zikadenvektoren freigesetzt werden.
Abstract
Insektenvektoren übertragen horizontal viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von hemipterischen Insekten übertragen, die stechend-saugende Mundwerkzeuge haben. Während der Virusübertragung überbrückt der Insektenspeichel den Virus-Vektor-Wirt, da der Speichel Viren vektoriert und die Insektenproteine die Immunantwort von Pflanzen von Insekten in pflanzliche Wirte auslösen oder unterdrücken. Die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelproteinen wird zu einem neuen Schwerpunkt im Forschungsfeld der Arbovirus-Wirt-Interaktionen. Dieses Protokoll bietet ein System zum Nachweis von Proteinen im Speichel von Zikaden mit Hilfe des pflanzlichen Wirts. Als Beispiel dient der mit dem Reiszwergvirus (RDV) infizierte Zikadenvektor Nephotettix cincticeps. Das Vitellogenin und das Hauptprotein P8 des äußeren Kapsids P8 von RDV, das durch den Speichel von N. cincticeps vektorisiert wird, können gleichzeitig in der Reispflanze nachgewiesen werden, von der sich N. cincticeps ernährt. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung der Speichelproteine, die nach dem Fressen von Insekten vorübergehend im pflanzlichen Wirt zurückgehalten werden. Es wird angenommen, dass dieses Nachweissystem der Untersuchung von Interaktionen zwischen Hemipteran-Virus-Pflanze oder Hemipteran-Pflanze zugute kommen wird.
Introduction
Der Vektor-Wirt-Übertragungsmodus von Arboviren, ein grundlegendes Problem, steht an der Grenze der biologischen Wissenschaft. Viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung werden horizontal durch Insektenvektoren übertragen1. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von Hemiptera-Insekten übertragen, darunter Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse. Diese Insekten verfügen über besondere Merkmale, die es ihnen ermöglichen, Pflanzenviren effizient zu übertragen1. Sie besitzen stechend-saugende Mundwerkzeuge und ernähren sich vom Saft von Phloem und Xylem und scheiden ihren Speichelaus 1,2,3,4. Mit der Entwicklung und Verbesserung von Techniken wird die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelkomponenten zu einem neuen Schwerpunkt intensiver Forschung. Zu den bekannten Speichelproteinen im Speichel gehören zahlreiche Enzyme, wie Pektinesterase, Cellulase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Polyphenoloxidase und Saccharase, unter anderem 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den Proteinen im Speichel gehören auch Auslöser, die die Abwehrreaktion des Wirts auslösen und dadurch die Leistung von Insekten verändern, sowie Effektoren, die die Abwehr des Wirts unterdrücken, was die Fitness der Insekten verbessert, und Komponenten, die pathologische Reaktionen des Wirts hervorrufen14,15,16,17. Daher sind Speichelproteine wichtige Materialien für die Kommunikation zwischen Insekten und Wirten. Bei der Übertragung von Viren enthält der Speichel, der von den Speicheldrüsen stechend-saugender viruliferer Insekten abgesondert wird, auch virale Proteine. Virale Bestandteile nutzen den Speichelfluss, um sie vom Insekt an den Pflanzenwirt freizusetzen. Daher überbrückt der Speichel der Insekten die tritrophe Virus-Vektor-Wirt-Interaktion. Die Untersuchung der biologischen Funktion von Speichelproteinen, die von viruliferen Insekten sezerniert werden, hilft, die Beziehung zwischen Virus, Vektor und Wirt zu verstehen.
Für tierische Viren wird berichtet, dass der Speichel von Stechmücken die Übertragung und Pathogenität des West-Nil-Virus (WNV) und des Dengue-Virus (DENV) vermittelt. Das Speichelprotein AaSG34 fördert die Replikation und Übertragung des Dengue-2-Virus, während das Speichelprotein AaVA-1 die Übertragung von DENV und dem Zika-Virus (ZIKV) fördert, indem es die Autophagie aktiviert18,19. Das Speichelprotein D7 von Stechmücken kann die DENV-Infektion in vitro und in vivo durch direkte Interaktion mit den DENV-Virionen und dem rekombinanten DENV-Hüllprotein20 hemmen. In Pflanzenviren induziert das Begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) das Speichelprotein Bsp9 der Weißen Fliege, das die WRKY33-vermittelte Immunität des pflanzlichen Wirts unterdrückt, um die Präferenz und Leistung der Weißen Fliege zu erhöhen und schließlich die Übertragung von Viren zu erhöhen21. Da die Studien zur Rolle von Speichelproteinen von Insekten in pflanzlichen Wirten hinter denen tierischer Wirte zurückgeblieben sind, ist ein stabiles und zuverlässiges System zum Nachweis der Speichelproteine in pflanzlichen Wirten dringend erforderlich.
Das als Reiszwergvirus (RDV) bekannte Pflanzenvirus wird von der Zikade Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) mit hoher Effizienz und persistent vermehrend übertragen22,23. Zuerst wurde berichtet, dass RDV durch einen Insektenvektor übertragen wird und in Asien eine schwere Erkrankung von Reis verursacht24,25. Das Virion ist ikosaedrisch und doppellagig kugelförmig, und die äußere Schicht enthält das äußere KapsidproteinP8 22. Die zirkulative Übertragungszeit von RDV in N. cincticeps beträgt 14 Tage 26,27,28,29,30. Wenn das RDV in den Speicheldrüsen ankommt, werden Virionen über einen Exozytose-ähnlichen Mechanismus in die im Speichel gespeicherten Hohlräume in den Speicheldrüsen freigesetzt23. Das Vitellogenin (Vg) ist die Vorstufe des Dotterproteins, die für die Entwicklung der Eizellen bei weiblichen Insekten unerlässlichist 31,32,33. Die meisten Insektenarten haben mindestens ein Vg-Transkript von 6-7 kb, das für ein Vorläuferprotein von etwa 220 kDa kodiert. Die Proteinvorstufen von Vg können in der Regel in große (140 bis 190 kDa) und kleine (<50 kDa) Fragmente gespalten werden, bevor sie in den Eierstock gelangen18,19. Frühere proteomische Analysen zeigten das Vorhandensein der von Vg abgeleiteten Peptide im sezernierten Speichel der Zikade Recilia dorsalis, obwohl ihre Funktion unbekannt ist (unveröffentlichte Daten). Es wird neu berichtet, dass Vg, das oral von Zikaden abgesondert wird, als Effektor fungiert, um die Abwehrkräfte von Pflanzen zu schädigen34. Es ist nicht bekannt, ob das Vg von N. cincticeps auch mit Speichelfluss an den Pflanzenwirt abgegeben werden kann und dann in der Pflanze eine Rolle spielen könnte, um die pflanzliche Abwehr zu stören. Um herauszufinden, ob N. cincticeps Speichelproteine wie Vg nutzt, um die pflanzliche Abwehr zu hemmen oder zu aktivieren, besteht der erste Schritt darin, Proteine zu identifizieren, die während der Fütterung an die Pflanze abgegeben werden. Das Verständnis der Methode zur Identifizierung der in der Pflanze vorhandenen Speichelproteine ist möglicherweise unerlässlich, um die Funktion von Speichelproteinen und die Wechselwirkungen zwischen Hemiptera und Pflanzen zu erklären.
In dem hier vorgestellten Protokoll wird N. cincticeps als Beispiel verwendet, um eine Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins von Speichelproteinen im pflanzlichen Wirt bereitzustellen, die durch Insektenfraß eingeführt werden. Das Protokoll beschreibt in erster Linie die Sammlung und den Nachweis von Speichelproteinen und ist hilfreich für weitere Untersuchungen an den meisten Hemipteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Speichel, der direkt von den Speicheldrüsen der stechend-saugenden Insekten abgesondert wird, spielt eine entscheidende Rolle, da er das Wirtsgewebe vorverdaut und entgiftet und die lebensreichsübergreifenden biologischen Faktoren der Vektoren in den Wirt einbringt 1,3,4. Die weltverbandsübergreifenden biologischen Faktoren, einschließlich Elicitoren, Effektoren und kleiner RNA, sind entscheidend für die Kommunikation z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31772124 und 31972239) und der Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014) unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
Riferimenti
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