Обнаружение вирусов и белков слюны переносчика цикадки в растении-хозяине
Summary
Этот протокол демонстрирует, как использовать растение-хозяина для обнаружения белков слюны цикадки и вирусных белков растений, высвобождаемых векторами цикадки.
Abstract
Насекомые-переносчики горизонтально переносят многие вирусы растений, имеющие сельскохозяйственное значение. Более половины вирусов растений передаются полужесткокрылыми насекомыми, имеющими колюще-сосущий ротовой аппарат. Во время передачи вируса слюна насекомого соединяет вирус-вектор-хозяина, потому что вирусы-переносчики слюны и белки насекомых запускают или подавляют иммунный ответ растений от насекомых к растениям-хозяевам. Идентификация и функциональный анализ белков слюны становятся новым направлением в области исследований взаимодействий арбовируса и хозяина. Этот протокол предоставляет систему для обнаружения белков в слюне цикадок с использованием растения-хозяина. В качестве примера можно привести переносчик цикадок Nephotettix cincticeps, зараженный вирусом рисовой карликовости (RDV). Вителлогенин и основной наружный капсидный белок P8 RDV, векторизуемые слюной N. cincticeps, могут быть обнаружены одновременно в рисовом растении, которым питается N. cincticeps. Этот метод применим для тестирования белков слюны, которые временно сохраняются в растении-хозяине после кормления насекомыми. Считается, что эта система обнаружения будет полезна для изучения взаимодействий между полужесткокрылыми и растениями или полужесткокрылыми и растениями.
Introduction
Способ передачи арбовирусов от вектора-хозяина, фундаментальная проблема, находится на переднем крае биологической науки. Многие вирусы растений, имеющие сельскохозяйственное значение, передаются по горизонтали насекомыми-переносчиками1. Более половины вирусов растений являются переносчиками полужесткокрылых насекомых, включая тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов. Эти насекомые обладают отличительными особенностями, которые позволяют им эффективно передавать вирусы растений1. Они обладают колюще-сосущим ротовым аппаратом и питаются соком из флоэмы и ксилемы, а также выделяют свою слюну 1,2,3,4. С развитием и совершенствованием методов идентификация и функциональный анализ компонентов слюны становятся новым направлением интенсивных исследований. Известные белки слюны в слюне включают многочисленные ферменты, такие как пектинэстераза, целлюлаза, пероксидаза, щелочная фосфатаза, полифенолоксидаза и сахараза, среди прочего 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Белки в слюне также включают элиситоры, которые запускают защитную реакцию хозяина, тем самым изменяя производительность насекомых, и эффекторы, которые подавляют защиту хозяина, что повышает приспособленность насекомых и компоненты, которые вызывают патологические реакции хозяина14,15,16,17. Таким образом, белки слюны являются жизненно важными материалами для общения между насекомыми и хозяевами. При передаче вирусов слюна, выделяемая слюнными железами колюще-сосущих, вируленосных насекомых, также содержит вирусные белки. Вирусные компоненты используют поток слюны, чтобы выпустить их от насекомого к растению-хозяину. Таким образом, слюна насекомого соединяет тритрофическое взаимодействие вирус-вектор-хозяин. Изучение биологической функции белков слюны, выделяемых вирующими насекомыми, помогает понять взаимосвязь вирус-вектор-хозяин.
Что касается вирусов животных, то, как сообщается, слюна комаров опосредует передачу и патогенность вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса денге (DENV). Белок слюны AaSG34 способствует репликации и передаче вируса денге-2, в то время как белок слюны AaVA-1 способствует передаче DENV и вируса Зика (ZIKV), активируя аутофагию18,19. Белок слюны D7 комаров может ингибировать инфекцию DENV in vitro и in vivo посредством прямого взаимодействия с вирионами DENV и рекомбинантным белком оболочки DENV20. В вирусах растений вирус бегомовируса желтой курчавости листьев томатов (TYLCV) индуцирует белокрылку белокрылки слюнный белокрылка Bsp9, который подавляет WRKY33-опосредованный иммунитет растения-хозяина, чтобы увеличить предпочтение и производительность белокрылки, в конечном итоге увеличивая передачу вирусов21. Поскольку исследования роли, которую белки слюны насекомых играют в растениях-хозяевах, отстают от таковых у животных-хозяев, срочно требуется стабильная и надежная система для обнаружения белков слюны в растениях-хозяевах.
Вирус растений, известный как вирус рисовой карликовости (RDV), передается цикадкой Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) с высокой эффективностью и настойчивым размножением22,23. Впервые сообщалось, что RDV передается насекомым-переносчиком и вызывает тяжелое заболевание риса в Азии24,25. Вирион икосаэдрический и двухслойный сферический, а внешний слой содержит белок внешнего капсидаP8 22. Период циркуляционной передачи РДВ при N. cincticeps составляет 14 дней 26,27,28,29,30. Когда RDV достигает слюнных желез, вирионы высвобождаются в слюнные полости в слюнных железах с помощью экзоцитозоподобного механизма23. Вителлогенин (Vg) является предшественником белка желтка, необходимого для развития ооцитов у самок насекомых31,32,33. Большинство видов насекомых имеют, по крайней мере, один транскрипт Vg размером 6-7 кб, который кодирует белок-предшественник примерно 220 кДа. Белковые предшественники Vg обычно могут быть расщеплены на крупные (от 140 до 190 кДа) и мелкие (<50 кДа) фрагменты перед попаданием в яичник18,19. Предыдущий протеомный анализ выявил присутствие пептидов, полученных из Vg, в секретируемой слюне цикадки Recilia dorsalis, хотя их функция неизвестна (неопубликованные данные). Недавно сообщалось, что Vg, который перорально секретируется из кузнечиков, функционирует как эффектор, повреждая защитные силы растений34. Неизвестно, может ли Vg N. cincticeps также высвобождаться в растение-хозяина с потоком слюны, а затем может играть роль в растении, мешая защите растений. Чтобы выяснить, использует ли N. cincticeps белки слюны, такие как Vg, для ингибирования или активации защиты растений, первым шагом является идентификация белков, высвобождаемых растению во время кормления. Понимание метода идентификации белков слюны, присутствующих в растении, потенциально необходимо для объяснения функции белков слюны и взаимодействия между полужесткокрылыми и растениями.
В протоколе, представленном здесь, N. cincticeps используется в качестве примера для обеспечения метода изучения присутствия белков слюны в растении-хозяине, введенном через кормление насекомыми. Протокол в первую очередь детализирует сбор и обнаружение белков слюны и полезен для дальнейшего исследования большинства полужесткокрылых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Слюна, непосредственно выделяемая слюнными железами колюще-сосущих, играет ключевую роль, поскольку она предварительно переваривает и детоксифицирует ткани хозяина и межцарственные биологические факторы переносчиков в хозяев 1,3,4. Б?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31772124 и 31972239) и Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства (грант KSYLX014).
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
Riferimenti
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. , (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid’s saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant–insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
