Summary
Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.
Abstract
Il rilevamento dell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è un metodo indispensabile nella stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo (MM), che è una delle neoplasie ematologiche più comuni. La caratteristica identificativa del MM è l'accumulo di plasmacellule maligne nel midollo osseo. I rapporti FISH per MM si concentrano principalmente sulle plasmacellule clonali purificate o identificate, piuttosto che su tutte le cellule nucleate, ordinando con perline magnetiche anti-CD138 o marcando con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. I nuclei interfasici del midollo osseo sono solitamente ottenuti da cellule fresche del midollo osseo. Tuttavia, un arricchimento soddisfacente dei campioni di plasmacellule richiede grandi quantità di eparina fresca anticoagulato, che non può essere ottenuta in caso di estrazione difficile del midollo osseo o di un rubinetto secco del midollo osseo. Qui, stabiliamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH su strisci di midollo osseo macchiati o non macchiati. Gli strisci di midollo osseo sono più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulato.
Introduction
Il mieloma multiplo (MM) è una malattia maligna delle plasmacellule (PC) con forte eterogeneità biologica e grandi differenze individuali nell'efficacia clinica, con periodi di sopravvivenza che vanno da mesi a decenni. Le caratteristiche citogenetiche sono importanti indicatori prognostici del MM. Il sistema di stratificazione del rischio e i trattamenti individualizzati basati su caratteristiche genetiche sono diventati argomenti di intenso interesse nella ricerca clinica sulla MM1. Le aberrazioni dei PC testati in un pannello di ibridazione fluorescente in situ (FISH) di midollo osseo (BM) includono del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification e 1p (CDKN2C) deletion.
La citogenetica standard delle metafasi deve essere inclusa nella valutazione iniziale dei pazienti con MM. Sebbene il cariotipo convenzionale a banda G offra il vantaggio di un'analisi dell'intero cromosoma, la bassa resa di questo metodo porta a molti risultati falsi negativi2. Tradizionalmente, i PC sono stati visti come in gran parte incapaci di scissione perché sono i prodotti allo stadio terminale della differenziazione dei linfociti B. Ciò rende difficile ottenere immagini divise. Una migliore analisi citogenetica nel MM con colture a lungo termine (6 giorni) e la stimolazione delle colture da parte delle citochine possono essere un metodo promettente per identificare le anomalie citogenetiche nei pazienti con MM di nuova diagnosi3. Anche quando il tempo di coltura è stato prolungato a 6 giorni, tuttavia, le anomalie citogenetiche sono state accuratamente riportate nel 30%-50% dei pazienti con MM4. Inoltre, il MM è caratterizzato da aberrazioni citogenetiche complesse che riflettono la sua eterogeneità prognostica. Tuttavia, la risoluzione della tradizionale tecnologia di banding cromosomico è bassa, il che può facilmente portare alla mancata rilevazione di anomalie cromosomiche nel MM.
La FISH interfase, preferibilmente dopo smistamento o marcatura con PC a base di perline magnetiche CD138-positive con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ/λ, è indispensabile nell'analisi di MM5,6. Un campione selezionato CD138-positivo è fortemente raccomandato per la resa ottimizzata delle cellule tumorali. Tuttavia, una quantificazione accurata delle aberrazioni citogenetiche richiede almeno 4 ml di BM anticoagulato per lo smistamento del PC. Inoltre, le combinazioni di SMistamento immunomagnetico delle perline CD138 con FISH o immunoglobuline citoplasmatiche a catena leggera κ/λ con test FISH (cIg-FISH) aumentano numerosi costi sperimentali e richiedono molto tempo.
Di solito, il rapporto PC viene prima valutato dall'esame morfologico di strisci bm colorati o sezioni di biopsia BM7,8. I campioni di BM di altissima qualità (campioni di primo aspirato di midollo) vengono utilizzati per i test morfologici, mentre quelli inviati per FISH o altra rilevazione sono spesso i campioni di aspirato secondario con alti rapporti di diluizione con sangue periferico.
Già nel 1990, diversi studi hanno dimostrato che gli strisci BM possono essere utilizzati direttamente per gli esami FISH interstiziali, che ha dimostrato di essere un metodo affidabile e ripetibile9. Un elegante studio basato sulla morfologia cellulare e sulla citochimica dell'esterasi combinato con FISH di sangue periferico e strisci bm ha confermato il suo grande significato clinico per chiarire le anomalie cromosomiche in pazienti con leucemia granulocitica e linfocitica10.
Qui forniamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH interfase nei pazienti con MM.
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Protocol
Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan (n. 2019065). I campioni sono stati raccolti da un paziente di MM nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università di Wuhan (Cina).
1. Preparazione degli strisci BM
- Posizionare i primi 0,2 ml di soluzione bm su un vetrino monouso pulito.
- Distribuire le strisce BM a spessore uniforme con code affilate rimuovendo rapidamente il BM. Quindi, asciugare naturalmente.
- Coprire i film BM con 1 mL di soluzione Wright-Giemsa per circa 10 s a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 mL di tampone fosfato ai vetrini.
NOTA: Fare attenzione a evitare che la soluzione colorante si secchi o scorra via dai vetrini. - Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente.
- Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare PC maligni. I PC dovrebbero essere ben dispersi.
2. PRE-elaborazione FISH degli strisci BM
- Coprire l'area ibridata con una soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare i PC.
- Per preparare una soluzione fissativa fresca, mescolare metanolo con acido acetico glaciale in un rapporto di volume di 3: 1.
- Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata (dH2O) e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.
- Preriscaldare un barattolo contenente 2 tamponi SSC a 56 °C a bagnomaria. Diluire nuovamente il buffer a 20x SSC prima dell'uso.
- Per preparare 20x SSC, mescolare accuratamente 176 g di cloruro di sodio e 88 g di citrato di sodio con 800 mL di dH2O. Misurare il pH e regolare a pH 5,3 ± 0,2. Quindi, aggiungere dH2O per portare il volume finale a 1 L.
- Lavare lo striscio BM preparato nel tampone SSC 2x preriscaldato per 10 minuti, quindi immergerlo in acqua deionizzata a temperatura ambiente.
- Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo (70%, 85% e 100% di etanolo, ciascuno per 1 minuto). Asciugare all'aria lo striscio per 10 minuti.
3. BM striscio FISH e lavaggio
NOTA: tutti i passaggi sono stati eseguiti in una stanza buia per evitare la tempra della fluorescenza.
- Aggiungere la miscela di sonda TP53/centromero del cromosoma 17 (CEP17) all'area di ibridazione e coprirla con un coverslip. Premere delicatamente con una pinzetta a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto.
- Sigillare tutti i lati del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.
- Dopo la solidificazione del cemento di gomma, posizionare il vetrino su una macchina FISH automatica. Eseguire la denaturazione a 78 °C per 5 minuti, seguita dall'ibridazione a 37 °C durante la notte.
- Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare pinzette a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.
- Immergere la diapositiva in 2x SSC a temperatura ambiente per circa 1 o 2 minuti per lavare via il coperchio.
- Lavare il vetrino in tampone 68 °C preriscaldato 0,4x SSC/0,3% NP-40 a bagnomaria per 2 min.
- Preparare 0,4x SSC/0,3% NP-40 soluzione mescolando accuratamente 20 mL di 20x SSC (pH 5,3) con 950 mL di dH2O. Quindi, aggiungere 3 ml di NP-40 e mescolare accuratamente fino a completa dissoluzione. Misurare il pH e regolare a 7,0-7,5 con NaOH. Quindi, aggiungere dH2O per portare il volume finale della soluzione totale a 1 L.
- Lavare i vetrini con 2x SSC a bagnomaria a 37 °C per 1 min. Mettere in posizione verticale al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti.
- Aggiungere 10 μL di DAPI all'area ibridata e coprire con un coverslip.
4. Analisi e imaging FISH
- Visualizza il vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza.
- Utilizzare un filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.
- Utilizzare una sonda centromerale cromosomica per mostrare quanti cromosomi contiene una cellula. Etichetta CEP17 con fluorescenza verde. Utilizzare un filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Scatta un'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.
- Etichettare il gene TP53 con fluorescenza arancione. Utilizzare un filtro ottico al fluoroforo arancione a spettro per osservare TP53. Scatta un'immagine dei segnali TP53 sotto questo set.
- Unisci queste tre immagini ed esaminale per verificare la presenza di anomalie numeriche.
NOTA: In una normale cellula interfase, due segnali arancioni e due verdi sono osservati all'interno di un nucleo con fluorescenza blu, indicando una coppia di cromosoma 17 normale (Figura 1).
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Representative Results
Nella valutazione morfologica iniziale di un paziente con MM di nuova diagnosi, il 15% dei PC in uno striscio di BM è risultato avere nuclei più grandi e più scuri insieme a quantità maggiori di citoplasma rispetto ai normali PC (Figura 2A). Il primo tubo di BM anticoagulato di eparina rilevato con la tecnica dell'immunofenotipo ha rivelato solo il 2,3% dei PC monoclonali aberranti. Lo smistamento immunomagnetico delle perline CD138 in combinazione con FISH o la tecnica cIg-FISH è essenziale per ottenere un risultato FISH accurato. Tuttavia, il BM aspirato è limitato nel caso in cui si tratti di un rubinetto asciutto. Gli strisci BM sono stati utilizzati per testare la FISH interfase. Un PC binucleato rappresentativo nel film BM è stato localizzato da una pinza Vernier allo stadio del microscopio a fluorescenza (Figura 2B). FISH è stato applicato agli strisci BM per testare TP53 e CEP17. I risultati del FISH hanno mostrato quattro segnali arancioni e quattro verdi in un nucleo PC interfase (Figura 2C), suggerendo che quattro copie del cromosoma 17 erano localizzate nei nuclei PC metafase. I risultati del cariotipo sono stati ottenuti estendendo il tempo di coltura fino a 3 giorni e ulteriormente analizzati utilizzando il software analitico FISH (Figura 2D). L'accuratezza dei risultati FISH interfase sugli strisci BM è stata ulteriormente verificata.
Figura 1: Segnali normali della sonda FISH TP53/CEP17 per cellule interfasiche (1000x). L'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare era blu, il TP53 era arancione e il CEP17 era verde. In quelle 3 cellule interfase normali, entrambi due segnali arancioni e due verdi sono apparsi all'interno del nucleo blu-fluorescente, indicando due coppie del normale cromosoma 17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Morfologia e immagini genetiche del midollo osseo (BM) in pazienti con mieloma multiplo (MM). (A) Cellule del mieloma con distribuzione raggruppata indicata dalle frecce (
) dopo la colorazione di Wright-Giemsa dello striscio BM (1000×). (B) Cellule plasmacitoidi binucleate indicate da frecce (
) su un'immagine in scala di grigi scattata da una fotocamera in bianco e nero su un microscopio a fluorescenza (1000×). (C) TP53/ centromero del cromosoma 17 (CEP17) test della sonda di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per lo striscio BM. FISH rivela quattro segnali TP53 e quattro CEP17 in ciascun nucleo (→) (1000×). (D) Il cariogramma cromosomico anormale mostra due coppie di cromosoma 17 in un nucleo (
). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'applicazione della FISH alla stratificazione del rischio genetico nel MM è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma i PC clonali specificamente purificati o identificati mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. Interphase FISH dopo LO SMISTAMENTO PC o cIg-FISH è risultato significativo nella diagnosi di MM a causa della percentuale relativamente inferiore di PC nel BM. Tuttavia, questi metodi presentano alcune carenze, tra cui processi complessi, elevate richieste di campioni e alti costi sperimentali. Cinquanta PC possono essere rapidamente posizionati da una pinza Vernier allo stadio del microscopio. Gli strisci bm sono molto più facili da ottenere rispetto ai campioni di BM anticoagulante perché ottenere BM anticoagulante richiede procedure complesse per ottenere il nucleo. Di conseguenza, abbiamo stabilito un metodo convincente per lo striscio BM FISH per il rilevamento di cellule MM.
In primo luogo, gli strisci BM dovrebbero essere fatti da un analista morfologico esperto. Per diffondere il BM in strisci, lo spargitore viene posizionato davanti all'aspirato con un angolo di 30°-45° e tirato indietro per entrare in contatto con il fluido11. Quindi, lo spanditore viene spostato in avanti uniformemente in un movimento costante. La densità dello striscio BM deve essere adattata in modo che la lunghezza sia di circa tre quarti della diapositiva12. La pellicola BM deve essere più stretta della slitta per garantire che le celle su tutti i bordi possano essere rilevate13. La selezione dell'area di ibridazione e la localizzazione dei PC è stata fondamentale nel nostro protocollo, e questo richiede un analista morfologico esperto. Per gli strisci BM contenenti meno PC, i PC devono essere localizzati utilizzando un obiettivo di immersione in olio per microscopio a fluorescenza in avanti e pinze Vernier sul palco dell'obiettivo, e le loro immagini possono essere prese da scatti monocromatici. Ad esempio, se i PC rappresentavano solo il 3% delle cellule nucleate totali in un film BM mediante esame morfologico, una regione ibrida ben dispersa di 8 mm x 8 mm dovrebbe contenere non meno di 50 PC per un test FISH. Dopo l'ibridazione FISH, i segnali di fluorescenza in almeno 50 PC devono essere contati da un analista esperto14.
Tuttavia, una limitazione di questa tecnica è il requisito per nuovi strisci BM. Se gli strisci BM vengono conservati per oltre 2 anni, le immagini FISH risultanti potrebbero essere oscure, con conseguente interpretazione errata.
Nel loro insieme, il suddetto striscio BM FISH può essere ampiamente utilizzato per i pazienti con neoplasie ematologiche quando l'estrazione del BM è difficile o si verifica il rubinetto secco BM, anche nelle malattie ipoprolineative con meno cellule nucleate. Speriamo che più pazienti con neoplasie ematologiche possano beneficiare di questo metodo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo per l'innovazione di WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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