Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung
Summary
Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.
Abstract
Metastasierung ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen Barrieren überwinden müssen, die nur unvollständig durch In-vitro-Assays modelliert werden. Ein systematischer Workflow wurde unter Verwendung robuster, reproduzierbarer In-vivo-Modelle und standardisierter Methoden etabliert, um neue Akteure in der Melanommetastasierung zu identifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht Datenrückschlüsse in bestimmten experimentellen Stadien, um die Rolle eines Gens bei Metastasen genau zu charakterisieren. Modelle werden erstellt, indem genetisch veränderte Melanomzellen über intrakardiale, intradermale oder subkutane Injektionen in Mäuse eingeführt werden, gefolgt von einer Überwachung mit serieller In-vivo-Bildgebung . Sobald vordefinierte Endpunkte erreicht sind, werden Primärtumoren und/oder metastasentragende Organe entnommen und für verschiedene Analysen verarbeitet. Tumorzellen können sortiert und einer von mehreren “Omics”-Plattformen unterzogen werden, einschließlich der Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Organe werden bildgebenden und immunhistopathologischen Analysen unterzogen, um die Gesamtbelastung durch Metastasen zu quantifizieren und ihren spezifischen anatomischen Standort abzubilden. Diese optimierte Pipeline, einschließlich standardisierter Protokolle für Transplantation, Überwachung, Gewebeernte, -verarbeitung und -analyse, kann für patientenabgeleitete, kurzfristige Kulturen und etablierte menschliche und murine Zelllinien verschiedener solider Krebsarten übernommen werden.
Introduction
Die hohe Mortalität im Zusammenhang mit metastasierendem Melanom in Kombination mit einer zunehmenden Inzidenz von Melanomen weltweit 1 (geschätzter Anstieg von 7,86% bis2025) erfordert neue Behandlungsansätze. Fortschritte in der Zielentdeckung hängen von reproduzierbaren Metastasenmodellen ab, einem hochkomplexen Prozess. Während der Schritte der metastasierenden Kaskade müssen Melanomzellen unzählige Barrieren überwinden, um eine Umgehung des Immunsystems und die Besiedlung entfernter Gewebe zu erreichen2. Die Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit von Melanomzellen ergibt sich aus einer Vielzahl von Faktoren, darunter ihre hohe genetische Mutationslast 3 und ihr Neuralkammursprung, die eine entscheidende phänotypische Plastizitätverleihen 3,4,5. Bei jedem Schritt ermöglichen Transkriptionsprogramme es metastasierenden Melanomzellen, von einem Zustand in einen anderen zu wechseln, basierend auf Hinweisen aus dem Übersprechen mit der Mikroumgebung, bestehend aus dem Immunsystem6, dem extrazellulären Milieu7,8 und der zellulären Architektur der physischen Barrieren9, mit denen sie in Kontakt kommen. Zum Beispiel entziehen sich Melanomzellen der Immunüberwachung, indem sie die Expression wichtiger immunprimierender tumorsezernierter Faktoren herunterregulieren6.
Studien beschreiben eine “prämetastasierende Nische”, in der Melanomzellen Chemokine und Zytokine absondern, um das entfernte “Zielorgan” für Metastasen10 vorzubereiten. Diese Ergebnisse werfen wichtige Fragen über den Organtropismus metastasierender Melanomzellen und den anatomischen Weg auf, den sie nehmen, um auf entferntes Gewebe zuzugreifen. Nach der Intravasation ist bekannt, dass Melanomzellen durch Lymphatika (lymphatische Ausbreitung) und Blutgefäße (hämatogene Ausbreitung) metastasieren2,11. Während die meisten Patienten eine lokalisierte Erkrankung aufweisen, weist eine kleine Untergruppe von Fällen eine ferne metastasierende Erkrankung und keine lymphatische Verbreitung (negative Lymphknotenbeteiligung) auf11, was auf die Existenz alternativer metastasierender Wege für Melanome hindeutet.
Wenn sie eine metastasierende Stelle besiedeln, durchlaufen Melanomzellen epigenetische und metabolische Anpassungen12,13. Um auf neue Kompartimente zuzugreifen und in sie einzudringen, verwenden Melanomzellen Proteasen 14 und zytoskelettale Modifikationen 11,15, die es ihnen ermöglichen, zu ihrem neuen Standort zu gelangen und dort zu wachsen. Die Schwierigkeit bei der Bekämpfung von Melanomzellen liegt in der Komplexität und Anzahl solcher Anpassungen; Daher sollte sich das Feld bemühen, so viele Schritte und Anpassungen wie möglich experimentell nachzubilden. Trotz zahlreicher Fortschritte in in vitro Assays wie Organoiden und 3D-Kulturen16,17 rekapitulieren diese Modelle die in vivo metastatische Kaskade nur unvollständig.
Murine-Modelle haben sich als wertvoll erwiesen, indem sie ein Gleichgewicht zwischen Reproduzierbarkeit, technischer Machbarkeit und Simulation menschlicher Krankheiten gefunden haben. Intravaskuläre, orthotopisch und heterotopisch implantierte Melanomzellen aus patientenabgeleiteten Xenotransplantaten oder Kurzzeitkulturen in immungeschwächte oder humanisierte Mäuse stellen das Rückgrat der Zielentdeckung bei metastasierendem Melanom dar. Diesen Systemen fehlt jedoch oft eine entscheidende biologische Einschränkung der Metastasierung: das Immunsystem. Syngene Melanommetastasenmodelle, die diese Einschränkung besitzen, sind auf dem Gebiet relativ selten. Diese Systeme, die in immunkompetenten Mäusen entwickelt wurden, einschließlich B16-F1018, der YUMM-Familie der Zelllinien19, SM1 20, D4M3 21, RIM3 22 oder neuer, der RMS 23 und M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) 24 Melanom-Zelllinien, erleichtern die Untersuchung der komplexen Rolle der Immunantwort des Wirts bei der Melanomprogression.
Hier wird eine Pipeline zur Identifizierung von Melanommetastasenzielen vorgestellt. Mit zunehmenden und größeren “Omics” -Datensätzen, die aus Melanom-Patientenkohorten generiert werden, postulieren wir, dass Studien, die das klinischste Versprechen haben, diejenigen sind, die aus der Big-Data-Integration stammen, was zu einer akribischen funktionellen und mechanistischen Befragung führt25,26,27,28. Durch die Verwendung von Mausmodellen zur Untersuchung potenzieller Ziele im metastatischen Prozess können in vivo-spezifische Ereignisse und Gewebeinteraktionen berücksichtigt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer klinischen Translation erhöht wird. Mehrere Methoden zur Quantifizierung der metastatischen Belastung werden skizziert und liefern ergänzende Daten zu den Ergebnissen eines bestimmten Experiments. Ein Protokoll für die Einzelzellisolierung von Tumoren in verschiedenen Organen wird beschrieben, um die unvoreingenommene Charakterisierung der Genexpression in metastasierenden Zellen zu unterstützen, die der Einzelzell- oder Massen-RNA-Sequenzierung vorausgehen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieses technischen Berichts ist es, einen standardisierten, von oben nach unten gerichteten Workflow für die Untersuchung potenzieller Akteure bei Melanommetastasen anzubieten. Da In-vivo-Experimente kostspielig und zeitaufwendig sein können, sind Strategien zur Maximierung der Effizienz und zur Steigerung des Wertes der erhaltenen Informationen von größter Bedeutung.
Es ist unerlässlich, komplementäre Ansätze zu verwenden, um die Ergebnisse innerhalb desselben Experiments…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Division of Advanced Research Technologies (DART) an der NYU Langone Health und insbesondere dem Experimental Pathology Research Laboratory, dem Genome Technology Center, dem Cytometry and Cell Sorting Laboratory, dem Pre-Clinical Imaging Core, die teilweise durch den Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087 unterstützt werden. Wir danken der NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) für den Zugang zu patientenabgeleiteten Melanom-Kurzzeitkulturen + (10-230BM und 12-273BM), die durch IRB-genehmigte Protokolle (Universal Consent Study #s16-00122 und Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group Study # 10362) erhalten wurden. Wir danken Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) für die Bereitstellung von 113/6-4L und 131/4-5B1 Melanom-Zelllinien* und Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) für die Bereitstellung von WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 Melanom-Kurzzeitkulturen**. E.H. wird unterstützt von NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, einem American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award und einem NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: U.A.). Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt.
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
Riferimenti
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