פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה
Summary
מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.
Abstract
גרורות הן תהליך מורכב, הדורש מהתאים להתגבר על מחסומים שרק מודלים באופן חלקי על ידי בדיקות חוץ גופיות . זרימת עבודה שיטתית הוקמה תוך שימוש במודלים חזקים וניתנים לשחזור in vivo ובשיטות סטנדרטיות לזיהוי שחקנים חדשים בגרורות מלנומה. גישה זו מאפשרת הסקה של נתונים בשלבים ניסיוניים ספציפיים כדי לאפיין במדויק את תפקידו של הגן בגרורות. מודלים נקבעים על ידי החדרת תאי מלנומה מהונדסים גנטית באמצעות זריקות תוך-לבביות, תוך-עוריות או תת-עוריות לעכברים, ולאחר מכן ניטור באמצעות הדמיית in vivo סדרתית. ברגע שמגיעים לנקודות קצה שהוקמו מראש, גידולים ראשוניים ו/או איברים נושאי גרורות נקטפים ומעובדים לניתוחים שונים. ניתן למיין את תאי הגידול ולהכפיף אותם לכל אחת מכמה פלטפורמות ‘אומיקה’, כולל ריצוף RNA חד-תאי. איברים עוברים הדמיה וניתוחים אימונוהיסטופתולוגיים כדי לכמת את הנטל הכולל של גרורות ולמפות את מיקומן האנטומי הספציפי. ניתן לאמץ את הצינור הממוטב הזה, הכולל פרוטוקולים סטנדרטיים לחריטה, ניטור, קצירת רקמות, עיבוד וניתוח, עבור תרביות קצרות טווח שמקורן בחולה וקווי תאים אנושיים ומורין מבוססים של סוגי סרטן מוצקים שונים.
Introduction
התמותה הגבוהה הקשורה למלנומה גרורתית בשילוב עם שכיחות גוברת של מלנומה ברחבי העולם1 (עלייה מוערכת של 7.86% עד 2025) קוראים לגישות טיפול חדשות. ההתקדמות בגילוי מטרות תלויה במודלים הניתנים לשחזור של גרורות, תהליך מורכב ביותר. לאורך השלבים של המפל הגרורתי, תאי מלנומה חייבים להתגבר על אינספור מחסומים כדי להשיג התחמקות ממערכת החיסון והתיישבות של רקמות רחוקות2. העמידות ויכולת ההסתגלות של תאי מלנומה נובעים מגורמים רבים, כולל נטל המוטציה הגנטית הגבוהה שלהם3 ומקורם העצבי, המעניקים פלסטיות פנוטיפית חיונית 3,4,5. בכל שלב, תוכניות שעתוק מאפשרות לתאי מלנומה גרורתיים לעבור ממצב אחד למשנהו בהתבסס על רמזים מההצלבה עם המיקרו-סביבה, הכוללת את מערכת החיסון6, את הסביבה החוץ-תאית 7,8 ואת הארכיטקטורה התאית של מחסומים פיזיים9 שאיתם הם באים במגע. לדוגמה, תאי מלנומה חומקים ממעקב חיסוני על ידי הפחתת הוויסות של הביטוי של גורמים חשובים המופרשים על ידי גידולים המופרשים על-ידי מערכת החיסון6.
מחקרים מתארים “נישה פרמטסטטית”, שבמסגרתה תאי מלנומה מפרישים כימוקינים וציטוקינים כדי להכין את איבר ה”מטרה” המרוחק לגרורות10. ממצאים אלה מעלים שאלות חשובות לגבי טרופיזם האיברים של תאי מלנומה גרורתיים והדרך האנטומית שהם נוקטים כדי לגשת לרקמות רחוקות. לאחר התפשטות, ידוע שתאי מלנומה שולחים גרורות באמצעות לימפה (התפשטות לימפטית) וכלי דם (התפשטות המטוגנית)2,11. בעוד שרוב החולים נמצאים עם מחלה מקומית, תת-קבוצה קטנה של מקרים מציגה מחלה גרורתית מרוחקת וללא הפצה לימפטית (מעורבות שלילית של בלוטות הלימפה)11, מה שמרמז על קיומם של מסלולים גרורתיים חלופיים למלנומה.
כאשר הם מתיישבים באתר גרורתי, תאי מלנומה עוברים התאמות אפיגנטיות ומטבוליות12,13. כדי לגשת לתאים חדשים ופלשו אליהם, תאי מלנומה משתמשים בפרוטאזות14 ובשינויי שלד11,15, המאפשרים להם לחצות ולגדול במיקומם החדש. הקושי להתמקד בתאי מלנומה שוכן במורכבות ובמספר של התאמות כאלה; לפיכך, על התחום לעשות מאמצים ליצור מחדש באופן ניסיוני כמה שיותר שלבים והתאמות. למרות ההתקדמות הרבה במבחנים במבחנה כגון אורגנואידים ותרביות תלת-ממדיות 16,17, מודלים אלה רק משחזרים באופן חלקי את המפל הגרורתי in vivo.
מודלים של מורין הראו ערך על ידי יצירת איזון בין יכולת שכפול, היתכנות טכנית וסימולציה של מחלות אנושיות. באופן תוך-שרירי, אורתטופי והטרוטופי מושתל בתאי מלנומה מקסנוגרפטים שמקורם בחולה או מתרביות קצרות טווח לעכברים הסובלים מפגיעה במערכת החיסון או מהאנישה, מייצגים את עמוד השדרה של גילוי המטרה במלנומה גרורתית. עם זאת, מערכות אלה חסרות לעתים קרובות מגבלה ביולוגית מכרעת על גרורות: מערכת החיסון. מודלים של גרורות מלנומה סינגנית בעלי אילוץ זה הם נדירים יחסית בתחום. מערכות אלה, שפותחו בעכברים מדוכאי חיסון, כולל B16-F1018, משפחת YUMM של קווי תאים19, SM120, D4M321, RIM322 או לאחרונה, RMS23 ו- M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 קווי תאי מלנומה, מאפשרות לחקור את התפקיד המורכב של התגובה החיסונית של המארח בהתקדמות מלנומה.
כאן מוצג צינור לזיהוי מטרות של גרורות מלנומה. כאשר מערכי נתונים ‘אומיים’ הולכים וגדלים נוצרים מקבוצות חולי מלנומה, אנו מניחים שמחקרים המחזיקים בהבטחה הקלינית הגדולה ביותר הם אלה הנובעים משילוב ביג דאטה, מה שמוביל לחקירה פונקציונלית ומכניסטית קפדניתשל 25,26,27,28. על ידי שימוש במודלים של עכברים כדי לחקור מטרות פוטנציאליות בתהליך הגרורתי, ניתן להסביר אירועים ספציפיים ל-in vivo ואינטראקציות רקמה, ובכך להגדיל את ההסתברות לתרגום קליני. מתוארות שיטות רבות לכימות העומס הגרורתי, המספקות נתונים משלימים על התוצאות של כל ניסוי נתון. פרוטוקול לבידוד של תאים בודדים מגידולים באיברים שונים מתואר כדי לסייע באפיון בלתי מוטה של ביטוי גנים בתאים גרורתיים, שעשוי להקדים ריצוף RNA חד-תאי או בתפזורת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת דוח טכני זה היא להציע זרימת עבודה סטנדרטית מלמעלה למטה לחקירת שחקנים פוטנציאליים בגרורות מלנומה. מכיוון שניסויי in vivo יכולים להיות יקרים וגוזלים זמן רב, אסטרטגיות למקסום היעילות ולהעלאת הערך של המידע המתקבל הן בעלות חשיבות עליונה.
חובה להשתמש בגישות משלימות לאורך…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למחלקה לטכנולוגיות מחקר מתקדמות (DART) ב- NYU Langone Health, ובמיוחד למעבדה לחקר הפתולוגיה הניסויית, למרכז הטכנולוגי של הגנום, למעבדת ציטומטריה ומיון תאים, ליבת הדמיה פרה-קלינית, הנתמכים באופן חלקי על ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן פרלמוטר NIH / NCI 5P30CA016087. אנו מודים לקבוצה הבין-תחומית השיתופית של מלנומה של NYU (PI: Dr. Iman Osman) על מתן גישה לתרביות קצרות טווח של מלנומה שמקורן בחולה + (10-230BM ו- 12-273BM), אשר התקבלו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי IRB (מחקר הסכמה אוניברסלית #s16-00122 ומחקר קבוצת מלנומה שיתופית בין-תחומית #10362). אנו מודים לד”ר רוברט קרבל (אוניברסיטת טורונטו) על מתן קווי תאי מלנומה 113/6-4-4L ו-131/4-5B1* ולד”ר מיינהרד הרלין (מכון Wistar) על אספקת WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 תרביות מלנומה לטווח קצר**. E.H. נתמך על ידי NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, פרס המדע של האגודה האמריקאית לחקר מלנומה-מלנומה, ו-NIH Mellanoma SPORE (NCI P50 CA225450; פי: I.O.). איור 1 נוצר עם Biorender.com.
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
- Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
- Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Ricerca sul cancro. 67 (7), 3450-3460 (2007).
- Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
- Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
- Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
- Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
- Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine – Dermatology. 5, 307 (2018).
- Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
- Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
- Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
- Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Ricerca sul cancro. 72 (16), 3928-3937 (2012).
- Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
- Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
- Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Ricerca sul cancro. 76 (15), 4359-4371 (2016).
- Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
- Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
- Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
- de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
- Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
- Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
- Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
- Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
- Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
- Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
- Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).
