흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼
Summary
이 기사는 흑색종 전이의 새로운 후보 매개체와 그 작용 메커니즘을 테스트하는 데 사용되는 기술의 워크 플로우에 대해 설명합니다.
Abstract
전이는 복잡한 과정으로, 세포가 시험관내 분석에 의해서만 불완전하게 모델링되는 장벽을 극복해야 합니다. 강력하고 재현 가능한 생체 내 모델과 흑색종 전이에서 새로운 선수를 식별하기위한 표준화 된 방법을 사용하여 체계적인 워크 플로우가 수립되었습니다. 이 접근법은 특정 실험 단계에서 데이터 추론을 허용하여 전이에서 유전자의 역할을 정확하게 특성화합니다. 모델은 마우스에 심장내, 피내 또는 피하 주사를 통해 유전자 변형 흑색종 세포를 도입한 다음, 일련의 생체내 영상으로 모니터링함으로써 확립된다. 일단 미리 확립된 종점에 도달하면, 원발성 종양 및/또는 전이-보유 장기가 다양한 분석을 위해 수확되고 처리된다. 종양 세포를 분류하고 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함한 여러 ‘omics’플랫폼 중 하나를 실시할 수 있습니다. 장기는 전이의 전반적인 부담을 정량화하고 특정 해부학 적 위치를지도화하기 위해 이미징 및 면역 조직 병리학 적 분석을 거칩니다. 생착, 모니터링, 조직 수확, 처리 및 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 포함하는 이 최적화된 파이프라인은 환자 유도, 단기 배양 및 다양한 고형암 유형의 확립된 인간 및 뮤린 세포주에 채택될 수 있다.
Introduction
전이성 흑색종과 관련된 높은 사망률과 전 세계적으로 흑색종의 발생률 증가와 결합 1 (2025 년까지 약 7.86 % 증가)은 새로운 치료 접근법을 요구합니다. 표적 발견의 발전은 매우 복잡한 과정인 재현 가능한 전이 모델에 달려 있습니다. 전이성 캐스케이드의 단계를 통틀어, 흑색종 세포는 면역계 회피 및 먼 조직의 식민지화를 달성하기 위해 무수한 장벽을 극복해야 한다2. 흑색종 세포의 탄력성과 적응성은 높은 유전 적 돌연변이 부담 3과 신경 볏 기원을 포함한 다양한 요인에서 발생하며, 이는 중요한 표현형 가소성 3,4,5를 부여합니다. 각 단계에서, 전사 프로그램은 전이된 흑색종 세포가 면역계(6), 세포외 환경(7,8), 및 이들이 접촉하는 물리적 장벽(9)의 세포 구조를 포함하는 미세환경과의 누화로부터의 단서에 기초하여 한 상태에서 다른 상태로 전환하도록 허용한다. 예를 들어, 흑색종 세포는 중요한 면역프라이밍 종양-분비 인자6의 발현을 하향조절함으로써 면역 감시를 탈출한다.
연구는 흑색종 세포가 전이를 위해 먼 “표적”기관을 프라이밍하기 위해 케모카인과 사이토카인을 분비하는 “전이성 틈새 시장”을 기술합니다10. 이러한 발견은 전이성 흑색종 세포의 장기 기증과 먼 조직에 접근하기 위해 취하는 해부학 적 경로에 대한 중요한 질문을 제기합니다. 혈관 내 후, 흑색종 세포는 림프학(림프성 확산) 및 혈관(hematogenous spread)2,11을 통해 전이되는 것으로 알려져 있다. 대부분의 환자들이 국소화된 질환을 앓고 있는 반면, 소수의 사례들은 먼 전이성 질환과 림프 전파(음성 림프절 침범)11를 나타내지 않으며, 이는 흑색종에 대한 대안적인 전이성 경로의 존재를 시사한다.
그들이 전이성 부위를 식민지화할 때, 흑색종 세포는 후성유전학적 및 대사적 적응을 겪는다12,13. 새로운 구획에 접근하고 침범하기 위해, 흑색종 세포는 프로테아제 14 및 세포골격 변형11,15를 이용하여, 이들이 그들의 새로운 위치로 횡단하고 성장할 수 있게 한다. 흑색종 세포를 표적화하는 어려움은 그러한 적응의 복잡성과 수에 상주한다; 따라서 이 분야는 가능한 한 많은 단계와 적응을 실험적으로 재현하기 위해 노력해야 한다. 오가노이드 및 3D 배양물(16,17)과 같은 시험관내 분석에서의 수많은 진보에도 불구하고, 이들 모델은 단지 생체내 전이성 캐스케이드를 불완전하게 재분석한다.
뮤린 모델은 재현성, 기술적 타당성 및 인간 질병의 시뮬레이션 사이의 균형을 유지함으로써 가치를 보여주었습니다. 혈관내, 직교적 및 이종국적으로 이식된 흑색종 세포는 환자 유래 이종이식편 또는 단기 배양물로부터 면역-손상 또는 인간화 마우스로 전이성 흑색종에서 표적 발견의 중추를 나타낸다. 그러나 이러한 시스템은 종종 전이에 대한 중요한 생물학적 제약 조건, 즉 면역 체계가 부족합니다. 이 제약을 가진 합성 흑색종 전이 모델은 현장에서 상대적으로 부족합니다. 이들 시스템은, B16-F10 18, YUMM 패밀리 세포주19, SM1 20, D4M3 21, RIM322 또는 보다 최근에, RMS 23 및M1 (Mel114433),M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 흑색종 세포주를 포함하는 면역적격 마우스에서 개발되어, 흑색종 진행에서 숙주 면역 반응의 복잡한 역할의 조사를 용이하게 한다.
여기서, 흑색종 전이 표적 식별을 위한 파이프라인이 제시된다. 흑색종 환자 코호트에서 점점 더 큰 ‘omics’데이터 세트가 생성됨에 따라, 우리는 가장 임상 적 약속을 지키고있는 연구가 빅 데이터 통합에서 비롯된 연구이며 세심한 기능 및 기계론적 심문25,26,27,28로 이어진다고 가정합니다. 마우스 모델을 사용하여 전이성 과정에서 잠재적 표적을 연구함으로써, 생체내 특이적 사건 및 조직 상호작용을 설명할 수 있고, 따라서 임상 번역의 확률을 증가시킬 수 있다. 전이성 부담을 정량화하는 여러 가지 방법이 요약되어 주어진 실험 결과에 대한 보완적인 데이터를 제공합니다. 다양한 기관에서 종양으로부터 단리하기 위한 프로토콜이 단일 세포 또는 벌크 RNA 시퀀싱에 선행할 수 있는 전이성 세포에서 유전자 발현의 편향되지 않은 특성화를 돕기 위해 기술된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술 보고서의 목적은 흑색종 전이의 잠재적 인 행위자에 대한 조사를위한 표준화 된 상하 워크 플로우를 제공하는 것입니다. 생체 내 실험은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 효율성을 극대화하고 획득한 정보의 가치를 높이기 위한 전략이 가장 중요합니다.
동일한 실험 내에서 결과를 교차 검증하기 위해 보완적인 접근법을 사용하는 것이 필수?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NYU Langone Health의 DART(Advanced Research Technologies) 부서, 특히 Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087에 의해 부분적으로 지원되는 실험 병리학 연구소, 게놈 기술 센터, 세포측정 및 세포 분류 실험실, 전임상 이미징 코어에 감사드립니다. 우리는 IRB 승인 프로토콜 (Universal Consent study #s16-00122 및 학제 간 흑색종 협동 그룹 연구 #10362)을 통해 얻은 환자 유래 흑색종 단기 배양 + (10-230BM 및 12-273BM)에 대한 액세스를 제공 한 NYU 학제 간 흑색종 협력 그룹 (PI : Iman Osman 박사)에게 감사드립니다. 113/6-4L 및 131/4-5B1 흑색종 세포주*를 제공해주신 Robert Kerbel 박사(토론토 대학교)와 WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 흑색종 단기 배양**을 제공해주신 Meenhard Herlyn 박사(Wistar Institute)에게 감사드립니다. E.H.는 NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award 및 NIH Melanoma SPORE(NCI P50 CA225450; 파이 : I.O.). 그림 1은 Biorender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
Riferimenti
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