En robust upptäcktsplattform för identifiering av nya medlare av melanommetastaser
Summary
Denna artikel beskriver ett arbetsflöde av tekniker som används för att testa nya kandidatmedlare av melanommetastaser och deras verkningsmekanismer.
Abstract
Metastasering är en komplex process som kräver att celler övervinner barriärer som endast är ofullständigt modellerade av in vitro-analyser . Ett systematiskt arbetsflöde etablerades med hjälp av robusta, reproducerbara in vivo-modeller och standardiserade metoder för att identifiera nya aktörer inom melanommetastasering. Detta tillvägagångssätt möjliggör datainferens vid specifika experimentella stadier för att exakt karakterisera en gens roll i metastasering. Modeller etableras genom att införa genetiskt modifierade melanomceller via intrakardiella, intradermala eller subkutana injektioner i möss, följt av övervakning med seriell in vivo-avbildning . När företablerade effektmått har uppnåtts skördas och bearbetas primära tumörer och/eller metastasbärande organ för olika analyser. Tumörceller kan sorteras och utsättas för någon av flera “omics” -plattformar, inklusive encellig RNA-sekvensering. Organ genomgår avbildning och immunohistopatologiska analyser för att kvantifiera den totala bördan av metastaser och kartlägga deras specifika anatomiska läge. Denna optimerade pipeline, inklusive standardiserade protokoll för engraftment, övervakning, vävnadsskörd, bearbetning och analys, kan antas för patienthärledda, kortsiktiga kulturer och etablerade humana och murina cellinjer av olika fasta cancertyper.
Introduction
Den höga dödligheten i samband med metastaserande melanom i kombination med en ökande förekomst av melanom över hela världen1 (uppskattningsvis 7,86% ökning fram till 2025) kräver nya behandlingsmetoder. Framsteg inom målupptäckt hänger på reproducerbara modeller av metastasering, en mycket komplex process. Under stegen i den metastatiska kaskaden måste melanomceller övervinna otaliga hinder för att uppnå immunsystemets undvikande och kolonisering av avlägsna vävnader2. Melanomcellernas motståndskraft och anpassningsförmåga härrör från en mängd faktorer, inklusive deras höga genetiska mutationsbörda3 och deras neurala crest ursprung, vilket ger avgörande fenotypisk plasticitet 3,4,5. Vid varje steg tillåter transkriptionsprogram metastaserande melanomceller att växla från ett tillstånd till ett annat baserat på signaler från överhörningen med mikromiljön, bestående av immunsystemet6, den extracellulära miljön 7,8 och den cellulära arkitekturen för fysiska barriärer9 som de kommer i kontakt med. Till exempel undgår melanomceller immunövervakning genom att nedreglera uttrycket av viktiga immunprimande tumörutsöndrade faktorer6.
Studier beskriver en “premetastatisk nisch”, där melanomceller utsöndrar kemokiner och cytokiner för att prima det avlägsna “mål” -organet för metastasering10. Dessa fynd väcker viktiga frågor om organtropismen hos metastaserande melanomceller och den anatomiska vägen de tar för att komma åt avlägsna vävnader. Efter intravasering är melanomceller kända för att metastasera genom lymfatik (lymfatisk spridning) och blodkärl (hematogen spridning)2,11. Medan de flesta patienter som uppvisar lokaliserad sjukdom, uppvisar en liten delmängd av fallen avlägsen metastatisk sjukdom och ingen lymfatisk spridning (negativ lymfkörtelinvolvering)11, vilket tyder på förekomsten av alternativa metastatiska vägar för melanom.
När de koloniserar ett metastatiskt stället genomgår melanomceller epigenetiska och metaboliska anpassningar12,13. För att komma åt och invadera nya fack använder melanomceller proteaser14 och cytoskelettmodifieringar 11,15, vilket gör det möjligt för dem att korsa till och växa på sin nya plats. Svårigheten att rikta in sig på melanomceller ligger i komplexiteten och antalet sådana anpassningar; Fältet bör därför anstränga sig för att experimentellt återskapa så många steg och anpassningar som möjligt. Trots många framsteg inom in vitro-analyser som organoider och 3D-kulturer 16,17, sammanfattar dessa modeller endast ofullständigt den in vivo metastatiska kaskaden.
Murinmodeller har visat värde genom att hitta en balans mellan reproducerbarhet, teknisk genomförbarhet och simulering av mänsklig sjukdom. Intravaskulärt, ortotopiskt och heterotopiskt implanterade melanomceller från patienthärledda xenotransplantat eller kortvariga kulturer till immunförsvagade eller humaniserade möss utgör ryggraden i målupptäckten vid metastaserat melanom. Dessa system saknar emellertid ofta en avgörande biologisk begränsning av metastasering: immunsystemet. Syngena melanommetastasmodeller som har denna begränsning är relativt knappa inom området. Dessa system, utvecklade i immunkompetenta möss, inklusive B16-F1018, YUMM-familjen av cellinjer19, SM120, D4M321, RIM322 eller mer nyligen, RMS23 och M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) 24 melanomcellinjer, underlättar undersökningen av värdimmunsvarets komplexa roll i melanomprogression.
Här presenteras en pipeline för målidentifiering av melanommetastaser. Med ökande och större “omics” -dataset som genereras från melanompatientkohorter postulerar vi att studier som håller det mest kliniska löftet är de som härrör från stor dataintegration, vilket leder till noggrann funktionell och mekanistisk förhör 25,26,27,28. Genom att använda musmodeller för att studera potentiella mål i den metastatiska processen kan man redogöra för in vivo-specifika händelser och vävnadsinteraktioner, vilket ökar sannolikheten för klinisk översättning. Flera metoder för att kvantifiera metastatisk börda beskrivs, vilket ger kompletterande data om resultaten av ett givet experiment. Ett protokoll för encellsisolering från tumörer i olika organ beskrivs för att underlätta opartisk karakterisering av genuttryck i metastatiska celler, vilket kan föregå encells- eller bulk-RNA-sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med denna tekniska rapport är att erbjuda ett standardiserat, top-to-bottom arbetsflöde för undersökning av potentiella aktörer inom melanommetastasering. Eftersom in vivo-experiment kan vara kostsamma och tidskrävande är strategier för att maximera effektiviteten och öka värdet av den erhållna informationen av största vikt.
Det är absolut nödvändigt att använda kompletterande metoder hela tiden för att korsvalidera fynd inom samma experiment. Till exempel är …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar avdelningen för avancerad forskningsteknik (DART) vid NYU Langone Health, och i synnerhet Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, som delvis stöds av Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. Vi tackar NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) för att ge tillgång till patient-härledda melanom kortvariga kulturer + (10-230BM och 12-273BM), som erhölls genom IRB-godkända protokoll (Universal Consent-studie #s16-00122 och Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group study #10362). Vi tackar Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) för att ha tillhandahållit 113/6-4L och 131/4-5B1 melanomcellinjer* och Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) för att tillhandahålla WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanom kortsiktiga kulturer**. E.H. stöds av NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, ett American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award och ett NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figur 1 skapades med Biorender.com.
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
- Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
- Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Ricerca sul cancro. 67 (7), 3450-3460 (2007).
- Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
- Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
- Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
- Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
- Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine – Dermatology. 5, 307 (2018).
- Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
- Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
- Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
- Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Ricerca sul cancro. 72 (16), 3928-3937 (2012).
- Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
- Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
- Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Ricerca sul cancro. 76 (15), 4359-4371 (2016).
- Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
- Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
- Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
- de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
- Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
- Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
- Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
- Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
- Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
- Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
- Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).
