تحليل مجهري بالفيديو عالي السرعة لتشخيص الخط الأول لخلل الحركة الهدبوجي الأولي
Summary
يعد التحليل المجهري بالفيديو عالي السرعة أداة سهلة الأداء نسبيا وسريعة وفعالة من حيث التكلفة ، وفي أيدي ذوي الخبرة ، أداة موثوقة إلى حد كبير لتشخيص الخط الأول لخلل الحركة الهدبي الأولي ، والتي يجب أن تكون متاحة في كل مركز يشارك في التشخيص وعلاج أمراض الرئة الشديدة.
Abstract
خلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) هو اضطراب خلقي موروث في الغالب في سمة جسمية متنحية. يسبب هذا الاضطراب اضطرابا في حركة الأهداب ، مما يؤدي إلى ضعف شديد في إزالة الغشاء المخاطي الهدبي (MCC). إذا لم يتم تشخيصها أو تشخيصها بعد فوات الأوان ، فإن الحالة تؤدي إلى تطور توسع الشعب الهوائية وأضرار جسيمة للرئتين في وقت لاحق من الحياة. معظم طرق تشخيص PCD تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موارد اقتصادية واسعة النطاق لإنشائها. تحليل الفيديو المجهري عالي السرعة (HSVMA) هو الأداة التشخيصية الوحيدة لتصور وتحليل خلايا الجهاز التنفسي الحية مع ضرب الأهداب في المختبر. إنه سريع وفعال من حيث التكلفة ، وفي أيدي ذوي الخبرة ، موثوق به للغاية كأداة تشخيصية ل PCD. بالإضافة إلى ذلك ، لا تنطبق التدابير التشخيصية الكلاسيكية مثل المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) على بعض الطفرات لأن التغيرات المورفولوجية غائبة.
تصف هذه الورقة عملية جمع الخلايا الظهارية التنفسية ، ومزيد من التحضير للعينة ، وعملية HSVMA. كما نصف كيف يمكن الحفاظ على الخلايا المصقولة بنجاح دون أذى أو ضرب عن طريق الاحتفاظ بها في وسط مغذي للتخزين والنقل إلى موقع التحقيق في الحالات التي لا تمتلك فيها العيادة المعدات اللازمة لإجراء HSVMA. كما تظهر مقاطع فيديو تحتوي على أنماط ضرب مرضية من المرضى الذين يعانون من طفرة في جين سلسلة ذراع الداينين الثقيلة 11 (DNAH11) ، والتي لا يمكن تشخيصها ب TEM. نتيجة ل HSVMA غير حاسم بسبب عدوى الشعب الهوائية العليا ، وكذلك تنظيف الأسنان بالفرشاة غير الناجحة مع تراكب خلايا الدم الحمراء. مع هذه المقالة ، نود أن نشجع كل وحدة تتعامل مع مرضى أمراض الرئة وأمراض الرئة النادرة على إجراء HSVMA كجزء من تشخيصاتهم الروتينية اليومية ل PCD أو إرسال العينات إلى مركز متخصص في أداء HSVMA.
Introduction
خلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) هو اضطراب وراثي وراثي نادر ، والذي يسبب اضطرابات في حركة أهداب الضرب. إذا لم يتم تشخيصه ، فإنه يؤدي إلى تلف شديد في الرئة في وقت لاحق من الحياة بسبب ضعف شديد في MCC. في الماضي ، قدر انتشاره في حدود 1: 4000 إلى 50000. نظرا للتحسن المطرد في التشخيص والوعي المتزايد بالحالة ، تشير التحديثات حول انتشار PCD إلى أنه قد يكون أكثر شيوعا وربما يتراوح بين 1: 4000 إلى 20000 بدلا من1.2. ومع ذلك ، لا يزال المرضى الذين يعانون من PCD يعانون من نقص التشخيص أو التشخيص في وقت متأخر جدا 1,3. لذلك ، يجب أن يكون الرضع الذين يعانون من أي من السيتوس الخلقي في مقابل و / أو سيلان الأنف في الفترة المحيطة بالولادة ، والضائقة التنفسية لحديثي الولادة ، وانسداد الأنف ، وصعوبات التغذية مشتبها بهم في PCD. في وقت لاحق من الحياة ، التهاب الأذن الوسطى المزمن ، والالتهاب الرئوي المتكرر ، والتهاب الجيوب الأنفية الأنفية ، والسعال الرطب المزمن النموذجي بسبب ضعف MCC هي الأعراض المميزة ل PCD ، والتي في تركيبة مع توسع الشعب الهوائية وضعف وظائف الرئة ، تستمر في مرحلة البلوغ2.
يمكن تشخيص المرضى المشتبه في إصابتهم ب PCD باستخدام أدوات تشخيصية مختلفة. وقد اعتبر TEM المعيار الذهبي لتشخيص الخط الأول في الماضي. ومع ذلك ، فإن ما يصل إلى 30٪ من حالات PCD لا تظهر بنية فائقة غير طبيعية1،3،4،5،6 ، مما يتطلب نهجا تشخيصيا مختلفا. لذلك ، يقترح عدد متزايد من المراكز والمبادئ التوجيهية للجمعية الأوروبية للجهاز التنفسي (ERS) مزيجا من أكسيد النيتريك الأنفي (nNO) و HSVMA كتشخيص الخط الأول1،7،9،10. HSVMA و nNO هي أيضا الخيارات الأكثر فعالية من حيث التكلفة في تحديد المريض المصاب ب PCD11. ومع ذلك ، حتى لو تم تضمين الاختبارات الجينية في التشخيص ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه لا يوجد حاليا اختبار قائم بذاته أو مجموعة من الاختبارات التي يمكن أن تستبعد PCD مع اليقين بنسبة 100٪ 8,9,10.
من بين خيارات التشخيص المتاحة ، يعد HSVMA هو الاختبار الوحيد الذي يركز على الخلايا التنفسية الحية المغلفة بالأهداب ويقيم نمط الضربات الهدبية (CBP) وتردد الضربات الهدبية (CBF). على النقيض من TEM ، تتوفر نتائج HSVMA بسرعة ، عادة في يوم الاختبار ، في حين أن نتائج TEM قد تصل بعد أشهر من أخذ العينة. يمكن تطبيق HSVMA لجميع الفئات العمرية ، في حين أن nNO يتطلب درجة عالية من الامتثال ؛ عادة ما تكون محاولات استخدامه تحت سن 5 سنوات غير ناجحة10. في أيدي ذوي الخبرة ، HSVMA لديه حساسية ممتازة وخصوصية لتشخيص PCD بنسبة 100 ٪ و 96 ٪ ، على التوالي12.
تصف هذه الورقة الإجراء خطوة بخطوة لأداء HSVMA ، بما في ذلك حصاد خلايا الجهاز التنفسي المغلفة بالأهداب من التوربينات السفلية للأنف ، والحفاظ على الخلايا المحصودة في وسط مغذي للخلايا لنقلها إلى موقع التحقيق ، وعملية تحليل الفيديو المجهري لتحديد CBF و CBP. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض بعض مقاطع الفيديو من المرضى ، مقارنة CBPs العادية و CBFs مع وظيفة الأهداب غير الطبيعية (الفيديو 3 ، الفيديو 4 ، الفيديو 5 ، الفيديو 6 ، الفيديو 7 ، والفيديو 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف عملية تشخيص PCD باستخدام HSVMA ومناقشتها في ضوء تشخيص الخط الأول. على الرغم من سهولة إنشائها نسبيا ، وفعالة من حيث التكلفة11 ، وطريقة موثوقة في أيدي ذوي الخبرة12 ، فإن HSVMA ليس مقياسا تشخيصيا بدون مزالق. قد يكون CBF و CBP غير الطبيعيين ناتجين عن عدوى ثانوية ، مما…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن شكرنا الخاص لممرضة الأطفال السيدة يوهانا جوفانكوسكي على مساعدتها الممتازة في تنظيف الأسنان بالفرشاة. نود أيضا أن نعرب عن امتناننا الخاص للبروفيسور هيموت عمران (جامعة عيادة مونستر، المملكة المتحدة) لمنحه الإذن باستخدام الشكل التخطيطي للحركة الهدبية العادية من موقعه على الويب. وأخيرا، نود أن نشكر السيد آلان براون بكالوريوس (مع مرتبة الشرف)، PGCE، على التدقيق اللغوي للمخطوطة.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
Riferimenti
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
