Højhastigheds videomikroskopianalyse til førstelinjediagnose af primær ciliær dyskinesi
Summary
Højhastigheds videomikroskopianalyse er en relativt let at udføre, hurtig, omkostningseffektiv og i erfarne hænder et betydeligt pålideligt værktøj til førstelinjediagnostik af primær ciliær dyskinesi, som bør være tilgængelig i alle centre, der er involveret i diagnostik og behandling af alvorlige lungesygdomme.
Abstract
Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en medfødt lidelse, der overvejende er arvet i et autosomalt recessivt træk. Lidelsen forårsager forstyrrelse i bevægelsen af cilier, hvilket fører til alvorlig svækkelse af mucociliær clearance (MCC). Hvis udiagnosticeret eller diagnosticeret for sent, fører tilstanden til udvikling af bronchiectasis og alvorlig skade på lungerne senere i livet. De fleste af metoderne til diagnosticering af PCD er tidskrævende og kræver omfattende økonomiske ressourcer for at etablere dem. Højhastigheds videomikroskopianalyse (HSVMA) er det eneste diagnostiske værktøj til at visualisere og analysere levende åndedrætsceller med slående cilier in vitro. Det er hurtigt, omkostningseffektivt og i erfarne hænder meget pålideligt som et diagnostisk værktøj til PCD. Derudover er klassiske diagnostiske foranstaltninger såsom transmissionselektronmikroskopi (TEM) ikke anvendelige for nogle mutationer, da morfologiske ændringer er fraværende.
Dette papir beskriver processen med at indsamle respiratoriske epitelceller, den videre forberedelse af prøven og processen med HSVMA. Vi beskriver også, hvordan børstede celler med succes kan holdes uskadte og slå ved at opbevare dem i et nærende medium til opbevaring og transport til undersøgelsesstedet i tilfælde, hvor en klinik ikke har udstyret til at udføre HSVMA. Der vises også videoer med patologiske slagmønstre fra patienter med en mutation i dyneinarmens tunge kæde 11-gen (DNAH11), som ikke kan diagnosticeres med TEM; resultatet af en ufattelig HSVMA på grund af infektion i de øvre luftveje samt en mislykket børstning med overlejring af røde blodlegemer. Med denne artikel vil vi gerne opfordre alle enheder, der beskæftiger sig med pulmonologiske patienter og sjældne lungesygdomme, til at udføre HSVMA som en del af deres daglige rutinediagnostik for PCD eller sende prøverne over til et center med speciale i at udføre HSVMA.
Introduction
Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en sjælden, arvelig genetisk lidelse, som forårsager forstyrrelser i bevægelsen af at slå cilier. Hvis det ikke diagnosticeres, fører det til alvorlig lungeskade senere i livet på grund af alvorlig svækkelse af MCC. Tidligere er dens udbredelse blevet anslået til at ligge i intervallet 1: 4.000 til 50.000. På grund af støt forbedret diagnostik og en voksende bevidsthed om tilstanden tyder opdateringer om forekomsten af PCD på, at det kan være meget mere almindeligt og sandsynligvis i intervallet 1: 4.000 til 20.000 i stedet 1,2. Patienter med PCD er dog stadig underdiagnosticeret eller diagnosticeret for sent 1,3. Derfor bør spædbørn med enten medfødt situs inversus og/eller heterotaksi eller perinatal rhinoré, neonatal åndedrætsbesvær, en blokeret næse og fodringsvanskeligheder mistænkes for PCD. Senere i livet er kronisk otitis, tilbagevendende lungebetændelse, rhinosinusitis og en kronisk, typisk våd hoste på grund af nedsat MCC de kendetegnende symptomer på PCD, som i kombination med bronkiektase og nedsat lungefunktion fortsætter ind i voksenalderen2.
Patienter, der mistænkes for at have PCD, kan diagnosticeres ved hjælp af forskellige diagnostiske værktøjer. TEM er tidligere blevet betragtet som guldstandarden for førstelinjediagnostik. Imidlertid viser op til 30% af PCD-tilfælde ikke unormal ultrastruktur 1,3,4,5,6, hvilket kræver en anden diagnostisk tilgang. Derfor foreslår et stigende antal centre og retningslinjerne fra European Respiratory Society (ERS) en kombination af nasal nitrogenoxid (nNO) og HSVMA som førstelinjediagnostik 1,7,9,10. HSVMA og nNO er også de mest omkostningseffektive muligheder for at identificere en patient med PCD11. Men selv hvis genetisk testning var inkluderet i diagnosen, skal det huskes, at der i øjeblikket ikke er nogen selvstændig test eller kombination af tests, der kan udelukke PCD med 100% sikkerhed 8,9,10.
Ud af de tilgængelige diagnostiske muligheder er HSVMA den eneste test, der fokuserer på levende, ciliabelagte åndedrætsceller og evaluerer ciliary beat pattern (CBP) og ciliary beat frequency (CBF). I modsætning til TEM er resultaterne af HSVMA hurtigt tilgængelige, normalt på testdagen, mens resultaterne af TEM kan ankomme måneder efter, at prøven er taget. HSVMA kan anvendes til alle aldersgrupper, mens nNO kræver en høj grad af overholdelse; forsøg på at bruge det under 5 år er normalt mislykket10. I erfarne hænder har HSVMA fremragende følsomhed og specificitet til at diagnosticere PCD ved henholdsvis 100% og 96%12.
Dette papir beskriver den trinvise procedure til udførelse af HSVMA, herunder høst af ciliabelagte åndedrætsceller fra næsens ringere turbinat, bevarelse af høstede celler i et cellenærende medium til transport til undersøgelsesstedet og processen med mikroskopisk videoanalyse til bestemmelse af CBF og CBP. Derudover vises nogle videoklip fra patienter, der sammenligner normale CBP’er og CBF’er med unormal ciliafunktion (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 og Video 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives og diskuteres den diagnostiske proces for PCD ved hjælp af HSVMA i lyset af førstelinjediagnostik. På trods af at det er relativt let at etablere,omkostningseffektivt 11 og en pålidelig metode i erfarne hænder12, er HSVMA ikke en diagnostisk foranstaltning uden faldgruber. Unormal CBF og CBP kan skyldes sekundær infektion, hvilket fører til betændelse i broncho-respiratorisk epitel15, og af samme grund kan rygende individer have…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne udtrykke en særlig tak til den pædiatriske sygeplejerske fru Johanna Juvankoski for hendes fremragende hjælp med børstningerne. Vi vil også gerne udtrykke særlig taknemmelighed til professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) for at have givet tilladelse til at bruge det skematiske tal for normal ciliary motion fra deres hjemmeside. Endelig vil vi gerne takke Alan Brown BA (Hons), PGCE, for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
Riferimenti
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
