تسجيل فجوة تقاطع التيار من البويضات Xenopus
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن بروتينات تقاطع الفجوة في بويضات Xenopus وتسجيل تيار التقاطع بين بويضتين محددتين باستخدام مكبر صوت تجاري مصمم لتسجيل مشبك جهد البويضة المزدوج في وضع قياس التيار الجانبي العالي.
Abstract
التعبير غير المتجانس عن connexins و innexins في بويضات Xenopus هو نهج قوي لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية لتقاطعات الفجوة (GJs). ومع ذلك ، فإن هذا النهج يمثل تحديا تقنيا لأنه يتطلب مشبك جهد تفاضلي لبويضتين متعارضتين تتشاركان أرضية مشتركة. على الرغم من أن عددا صغيرا من المختبرات قد نجح في تنفيذ هذه التقنية ، إلا أن جميعها استخدمت بشكل أساسي إما مكبرات صوت محلية الصنع أو مكبرات صوت تجارية تم تصميمها لتسجيل البويضة الواحدة. غالبا ما يكون من الصعب على المختبرات الأخرى تنفيذ هذه التقنية. على الرغم من أن وضع قياس التيار الجانبي العالي قد تم دمجه في مكبر صوت تجاري لتسجيلات الجهد المزدوج للبويضات المشبك ، إلا أنه لم يكن هناك تقرير عن تطبيقه حتى دراستنا الأخيرة. لقد جعلنا نهج قياس التيار الجانبي العالي أكثر عملية وملاءمة من خلال إدخال العديد من التعديلات التقنية ، بما في ذلك بناء منصة تسجيل قائمة على المغناطيسية تسمح بوضع البويضات والأقطاب الكهربائية المختلفة بدقة ، واستخدام محلول الحمام كموصل في الأقطاب الكهربائية التفاضلية للجهد ، واعتماد قطب KCl تجاري منخفض التسرب كقطب مرجعي ، تصنيع أقطاب التيار والجهد من الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدار الرقيق ، وتحديد مواقع جميع الأقطاب الكهربائية باستخدام الأجهزة القائمة على المغناطيسية. تسمح الطريقة الموضحة هنا بتسجيلات مريحة وقوية للتيار الوصلة (Ij) بين بويضتين Xenopus متعارضتين.
Introduction
GJs هي قنوات بين الخلايا قد تسمح بالتدفق الحالي وتبادل الجزيئات الخلوية الصغيرة بين الخلايا المجاورة. وهي موجودة في العديد من أنواع الخلايا وتؤدي وظائف فسيولوجية متنوعة. تتشكل GJs في الفقاريات بواسطة connexins ، في حين أن تلك الموجودة في اللافقاريات بواسطة innexins. يتكون كل GJ من قناتين نصفيتين متجاورين مع 6 أو 8 وحدات فرعية لكل نصف قناة ، اعتمادا على ما إذا كانت connexins أو innexins 1,2,3. لدى البشر 21 جينا كونيكسين4 ، في حين أن نماذج اللافقاريات الشائعة الاستخدام C. elegans و Drosophila melanogaster لديها 25 و 8 جينات innexin ، على التوالي 5,6. قد يزيد الربط البديل للنسخ الجينية من تنوع بروتينات GJ ، على الأقل بالنسبة ل innexins 7,8.
يمكن تقسيم GJs إلى ثلاث فئات بناء على التراكيب الجزيئية: متماثلة النمط ، غير متجانسة ، وغير متجانسة. يحتوي GJ المتجانس على جميع وحداته الفرعية متطابقة. يحتوي GJ غير المتجانس على قناتين متماثلتين ، لكن النصفين يتشكلان بواسطة بروتينين GJ مختلفين. يحتوي GJ غير المتجانس على قناة نصف متجانسة واحدة على الأقل. قد تمنح الاختلافات الجزيئية ل GJs خصائص فيزيائية حيوية متميزة مهمة لوظائفها الفسيولوجية. يتم تعديل الخصائص الفيزيائية الحيوية GJ أيضا بواسطة البروتينات التنظيمية9. لفهم كيفية أداء GJs لوظائفها الفسيولوجية ، من المهم معرفة تركيباتها الجزيئية وخصائصها الفيزيائية الحيوية وأدوار البروتينات التنظيمية في وظائفها.
غالبا ما تستخدم أنظمة التعبير غير المتجانسة لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية للقنوات الأيونية ، بما في ذلك GJs ، وتأثيرات البروتينات التنظيمية عليها. نظرا لأن أنظمة التعبير غير المتجانسة تسمح بالتعبير عن بروتينات محددة ، فهي عموما أكثر قابلية لتشريح وظائف البروتين من الأنسجة الأصلية حيث يمكن للبروتينات ذات الوظائف الزائدة أن تعقد التحليل ، ويمكن أن يكون تسجيل Ij غير قابل للتحقيق. لسوء الحظ ، فإن خطوط الخلايا الأكثر استخداما باستثناء خلية Neuro-2A غير مناسبة لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية GJ بسبب المضاعفات الناجمة عن الوصلات الذاتية. حتى الخلايا العصبية 2A ليست مناسبة دائما لهذا النوع من التحليل. على سبيل المثال ، لم نتمكن من اكتشاف أي Ij في خلايا Neuro-2A المنقولة مع innexins UNC-7 و UNC-9 إما في غياب أو وجود UNC-1 (غير منشور) ، وهو مطلوب لوظيفة UNC-9 GJs في C. elegans 9,10. من ناحية أخرى ، تعد بويضات Xenopus نظاما بديلا مفيدا للتحليلات الكهروفسيولوجية ل GJs. على الرغم من أنها تعبر عن بروتين GJ داخلي المنشأ ، connexin 38 (Cx38) 11 ، يمكن تجنب المضاعفات المحتملة بسهولة عن طريق حقن oligonucleotide12 مضاد للإحساس محدد. ومع ذلك ، فإن تحليلات GJs مع بويضات Xenopus تتطلب مشبك الجهد التفاضلي لخليتين متجاورين ، وهو أمر صعب تقنيا. تم الإبلاغ عن النجاحات المبكرة لمشبك الجهد المزدوج لبلاستونات الضفادع منذ حوالي 40 عاما13,14. منذ ذلك الحين ، استخدمت العديد من الدراسات هذه التقنية لتسجيل Ij في بويضات Xenopus المقترنة. ومع ذلك ، فقد تم إجراء جميع الدراسات السابقة بشكل أساسي إما باستخدام مكبرات صوت محلية الصنع12،15،16 أو مكبرات صوت تجارية مصممة للتسجيلات على البويضات الفردية (GeneClamp 500 ، AxoClamp 2A ، أو AxoClamp 2B ، Axon Instruments ، Union City ، CA) 8،17،18،19،20 . نظرا لأنه حتى مكبرات الصوت التجارية لا توفر تعليمات لمشبك جهد البويضة المزدوج ، فغالبا ما يكون من الصعب على المختبرات الكهروفسيولوجية الجديدة أو الأقل تطورا تنفيذ هذه التقنية.
تم تطوير مضخم صوت تجاري واحد فقط لمشبك جهد البويضة المزدوج ، OC-725C من Warner Instruments (جدول المواد ، الشكل 1A). يمكن استخدام هذا المضخم إما في الوضع القياسي (للبويضات المفردة) أو وضع قياس التيار الجانبي العالي (للبويضات المفردة أو المزدوجة) اعتمادا على ما إذا كان هناك مقبسان في مسبار الجهد الخاص به متصلين (الشكل 1B ، C). ومع ذلك ، حتى دراستنا الأخيرة7 ، لم يكن هناك منشور واحد يصف استخدام هذا مكبر الصوت في وضع قياس التيار الجانبي العالي. على الرغم من أن مكبر الصوت قد تم استخدامه من قبل مختبر آخر لتسجيل البويضات المزدوجة ، إلا أنه تم استخدامه في الوضع القياسي بدلا من الوضع الجانبي العالي21,22. قد يكون هذا النقص في التقارير التي تستخدم مكبر الصوت في وضع القياس الحالي الجانبي العالي بسبب صعوبات فنية. لم نتمكن من الحصول على تسجيلات البويضات المزدوجة المستقرة باستخدام الوضع الجانبي العالي باتباع تعليمات من الشركة المصنعة. على مر السنين ، جربنا ثلاث طرق مختلفة لتسجيلات البويضات المزدوجة ، بما في ذلك استخدام اثنين من مكبرات الصوت OC-725C في وضع قياس التيار الجانبي العالي ، ومضخمي الصوت OC-725C في الوضع القياسي ، واثنين من مكبرات الصوت من شركة تصنيع أخرى. نجحنا في نهاية المطاف في الحصول على تسجيلات مستقرة فقط مع النهج الأول بعد تجربة وخطأ مكثفين. يصف هذا المنشور ويوضح الإجراءات التي نستخدمها للتعبير عن بروتينات GJ في بويضات Xenopus ، وتسجيل Ij باستخدام وضع قياس التيار الجانبي العالي ، وتحليل البيانات الكهروفسيولوجية باستخدام البرامج التجارية الشائعة. يمكن العثور على معلومات إضافية حول تقنية المشبك المزدوج الجهد في منشورات أخرى19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
يبدو أن تحسين النظام ضروري لتجارب مشبك الجهد المزدوج للبويضة. بدونها ، يمكن أن تكون التسجيلات غير مستقرة للغاية ، وقد تضطر مكبرات الصوت إلى حقن كمية زائدة من التيار للوصول إلى Vm المستهدف ، مما يؤدي إلى تلف البويضات وفشل التسجيل. هناك عدة عوامل حاسمة للحصول على تسجيلات مستقرة للبويضة ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر هاينغ زان ، وتشيان جي على مشاركتهم في المرحلة الأولية من التطوير التقني ، وكيرانماي فيدانتهام للمساعدة في الأرقام ، والدكتور كاميلو بيراكيا على المشورة بشأن غرفة إقران البويضات.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Riferimenti
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologia dello sviluppo. 156 (2), 490-499 (1993).
