Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi
Summary
Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Ksenopus oositlerinde konneksinlerin ve inneksinlerin heterolog ekspresyonu, boşluk kavşaklarının (GJ’ler) biyofiziksel özelliklerini incelemek için güçlü bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, bu yaklaşım teknik olarak zordur, çünkü ortak bir zemini paylaşan iki karşıt oositin diferansiyel voltaj kelepçesini gerektirir. Az sayıda laboratuvar bu tekniği gerçekleştirmeyi başarmış olsa da, esasen hepsi ev yapımı amplifikatörler veya tek oosit kayıtları için tasarlanmış ticari amplifikatörler kullanmıştır. Diğer laboratuvarların bu tekniği uygulaması genellikle zordur. Çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için ticari bir amplifikatöre yüksek yan akım ölçüm modu dahil edilmiş olmasına rağmen, son çalışmamıza kadar uygulanması için bir rapor bulunmamıştır. Oositlerin ve çeşitli elektrotların hassas bir şekilde yerleştirilmesini sağlayan manyetik tabanlı bir kayıt platformunun inşası, banyo çözeltisinin voltaj diferansiyel elektrotlarında iletken olarak kullanılması, referans elektrot olarak ticari bir düşük sızıntılı KCl elektrodunun benimsenmesi dahil olmak üzere çeşitli teknik modifikasyonlar getirerek yüksek taraf akım ölçüm yaklaşımını daha pratik ve kullanışlı hale getirdik. İnce duvarlı cam kılcal damarlardan akım ve gerilim elektrotlarının imalatı ve manyetik tabanlı cihazlar kullanılarak tüm elektrotların konumlandırılması. Burada açıklanan yöntem, iki karşıt Xenopus oositi arasındaki birleşim akımının (Ij) uygun ve sağlam bir şekilde kaydedilmesini sağlar.
Introduction
GJ’ler, komşu hücreler arasında küçük sitozolik moleküllerin akım akışına ve değişimine izin verebilecek hücreler arası kanallardır. Birçok hücre tipinde bulunurlar ve çeşitli fizyolojik işlevleri yerine getirirler. Omurgalılardaki GJ’ler konneksinler tarafından oluşturulurken, omurgasızlardaki GJ’ler inneksinler tarafından oluşturulur. Her GJ, konneksin veya ineksin 1,2,3 olup olmadıklarına bağlı olarak, hemikanal başına 6 veya 8 alt üniteye sahip iki yan yana hemikanaldan oluşur. İnsanlarda 21 konneksin geni4 bulunurken, yaygın olarak kullanılan omurgasız modeller C. elegans ve Drosophila melanogaster’de sırasıyla 25 ve 8 inteksin geni vardır, 5,6. Gen transkriptlerinin alternatif olarak eklenmesi, en azından innexins 7,8 için GJ proteinlerinin çeşitliliğini daha da artırabilir.
GJ’ler moleküler bileşimlere göre üç kategoriye ayrılabilir: homotipik, heterotipik ve heteromerik. Homotipik bir GJ’nin tüm alt birimleri aynıdır. Heterotipik bir GJ’nin iki homomerik hemikanalı vardır, ancak iki hemikanal iki farklı GJ proteini tarafından oluşturulur. Heteromerik bir GJ en az bir heteromerik hemikanal içerir. GJ’lerin moleküler çeşitlilikleri, fizyolojik işlevleri için önemli olan farklı biyofiziksel özellikler kazandırabilir. GJ biyofiziksel özellikleri de düzenleyici proteinler tarafından modüle edilir9. GJ’lerin fizyolojik işlevlerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak için, moleküler bileşimlerini, biyofiziksel özelliklerini ve düzenleyici proteinlerin işlevlerindeki rollerini bilmek önemlidir.
Heterolog ekspresyon sistemleri genellikle GJ’ler de dahil olmak üzere iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini ve düzenleyici proteinlerin bunlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılır. Heterolog ekspresyon sistemleri spesifik proteinlerin ekspresyonuna izin verdiğinden, genellikle protein fonksiyonlarının diseksiyonuna, gereksiz fonksiyonlara sahip proteinlerin analizi zorlaştırabileceği doğal dokulardan daha uygundur ve Ij’nin kaydedilmesi mümkün olmayabilir. Ne yazık ki, Neuro-2A hücresi dışında en sık kullanılan hücre hatları, endojen konneksinlerin komplikasyonları nedeniyle GJ biyofiziksel özelliklerini incelemek için uygun değildir. Nöro-2A hücreleri bile bu tür analizler için her zaman uygun değildir. Örneğin, C. elegans 9,10’daki UNC-9 GJ’lerin işlevi için gerekli olan UNC-1’in (yayınlanmamış) yokluğunda veya varlığında, UNC-7 ve UNC-9 ile transfekte edilen Neuro-2A hücrelerinde herhangi bir Ij tespit edemedik. Öte yandan, Xenopus oositleri GJ’lerin elektrofizyolojik analizleri için yararlı bir alternatif sistemdir. Endojen bir GJ proteini olan konneksin 38 (Cx38)11’i ifade etmelerine rağmen, spesifik bir antisens oligonükleotid12 enjekte edilerek potansiyel komplikasyonlardan kolayca kaçınılabilir. Bununla birlikte, Xenopus oositleri ile GJ’lerin analizleri, teknik olarak zor olan yan yana duran iki hücrenin diferansiyel voltaj kelepçesini gerektirir. Kurbağa blastomerlerinin çift voltajlı kelepçesinin en erken başarıları yaklaşık 40 yıl önce13,14 olarak bildirilmiştir. O zamandan beri, birçok çalışma bu tekniği eşleştirilmiş Xenopus oositlerinde Ij’yi kaydetmek için kullanmıştır. Bununla birlikte, esasen önceki tüm çalışmalar ya ev yapımı amplifikatörler12,15,16 ya da tek oositler üzerinde kayıtlar için tasarlanmış ticari amplifikatörlerle (GeneClamp 500, AxoClamp 2A veya AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 ile gerçekleştirilmiştir. . Ticari amplifikatörler bile çift oosit voltaj kelepçesi için talimatlar sağlamadığından, yeni veya daha az karmaşık elektrofizyolojik laboratuvarların bu tekniği uygulaması genellikle zordur.
Çift yumurta voltaj kelepçesi için sadece bir ticari amplifikatör, Warner Instruments’tan OC-725C geliştirilmiştir (Malzeme Tablosu, Şekil 1A). Bu amplifikatör, voltaj probundaki iki soketin bağlı olup olmadığına bağlı olarak standart modda (tek oositler için) veya yüksek yan akım ölçüm modunda (tek veya çift oositler için) kullanılabilir (Şekil 1B, C). Bununla birlikte, son çalışmamız7’ye kadar, bu amplifikatörün yüksek yan akım ölçüm modunda kullanımını açıklayan tek bir yayın yoktu. Amplifikatör, başka bir laboratuvar tarafından çift oosit kayıtları için kullanılmasına rağmen, yüksek yan mod21,22 yerine standartta kullanılmıştır. Amplifikatörü yüksek yan akım ölçüm modunda kullanan bu rapor eksikliği, teknik zorluklardan kaynaklanıyor olabilir. Üreticinin talimatlarını izleyerek yüksek yan modu kullanarak kararlı çift oosit kayıtları elde edemedik. Yıllar geçtikçe, yüksek yan akım ölçüm modunda iki OC-725C amplifikatör, standart modda iki OC-725C amplifikatör ve başka bir üreticiden iki amplifikatör kullanmak da dahil olmak üzere çift oosit kayıtları için üç farklı yaklaşım denedik. Sonunda, yalnızca kapsamlı deneme yanılma sonrası ilk yaklaşımla istikrarlı kayıtlar elde etmeyi başardık. Bu yayın, Xenopus oositlerinde GJ proteinlerini eksprese etmek, yüksek yan akım ölçüm modunu kullanarak Ij’yi kaydetmek ve popüler ticari yazılımları kullanarak elektrofizyolojik verileri analiz etmek için kullandığımız prosedürleri açıklamakta ve göstermektedir. Çift voltaj kelepçesi tekniği hakkında ek bilgi diğer yayınlarda bulunabilir19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çift yumurta voltaj kelepçesi deneyleri için sistem optimizasyonu gerekli görünmektedir. Onsuz, kayıtlar oldukça kararsız olabilir ve amplifikatörlerin hedef Vm’ye ulaşmak için aşırı miktarda akım enjekte etmesi gerekebilir, bu da yumurta hasarına ve kayıt hatalarına neden olabilir. Yüksek yan akım ölçüm yöntemi ile stabil çift oosit kayıtları elde etmek için çeşitli faktörler kritik öneme sahiptir. İlk olarak, akım ve voltaj elektrotları uygun dirence (~ 1 MΩ) sahip olmalı v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Haiying Zhan’a, Qian Ge’ye teknik gelişimin ilk aşamasına katılımları için, Kiranmayi Vedantham’a rakamlara yardımcı oldukları için ve Dr. Camillo Peracchia’ya yumurta eşleştirme odası hakkında tavsiyeler için teşekkür ederiz.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Riferimenti
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologia dello sviluppo. 156 (2), 490-499 (1993).
