Summary
本方案描述了 美洲蚴中RNAi操作技术的分步指南。
Abstract
蟑螂是一种卫生害虫,由于其易于觅食和半代谢特性,是昆虫发育和变质研究中必不可少的物种。加上注释良好的基因组序列,这些优势使得美洲蟑螂, 美洲角行星, 成为重要的半代谢昆虫模型。受敲除策略不足的限制,基于有效RNA干扰(RNAi)的基因敲低成为 美洲桫椤功能基因研究中不可或缺的技术。本方案描述了 美洲猪笼草的RNAi操作技术。该方案包括(1)在适当的发育阶段选择 美洲疟原虫 ,(2)注射设置的准备,(3)dsRNA注射和(4)基因敲低效率检测。RNAi是 美洲猪笼草中一种强大的反向遗传工具。大多数 美洲疟原虫 组织对细胞外dsRNA敏感。它的简单性使研究人员能够在一次或多次靶向dsRNA注射下快速获得功能失调的表型,使研究人员能够更好地利用 美洲疟原虫 进行发育和变质研究。
Introduction
RNA干扰(RNAi)是一种进化保守的机制,自Andrew Fire和Craig Mello2开发出双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默策略以来,逐渐成为抑制许多生物体1中基因表达的重要反向遗传工具。dsRNA被细胞中的DsRNA切割成21-23个核苷酸的片段,小干扰RNA(siRNA),由细胞中的Dicer酶激活RNAi途径。然后将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中,该复合物与靶mRNA偶联,导致mRNA裂解,最终导致基因功能丧失3,4,5。在昆虫物种中,到目前为止,许多系统RNAi实验已经在许多昆虫目中报道,例如直翅目,等翅目,半翅目,鞘翅目,神经翅目,双翅目,膜翅目,鳞翅目和Blattodea5,6,7,8。
蟑螂(Blattaria)是发育和变质研究中必不可少的昆虫家族,其生长周期快,对环境适应性强,发育可塑性高9。在发现RNAi与蟑螂兼容之前,由于蟑螂遗传操纵技术的稀缺,以前的研究仅关注蟑螂的预防和控制。蟑螂卵子的独特结构使得使用CRISPR-Cas9系统进行基于胚胎注射的基因敲除具有挑战性。此外,蟑螂中的大多数组织(如美洲猪笼草)表现出强大的全身RNAi反应,允许通过注射一个或多个靶向dsRNA9,10,11来快速产生功能失调的表型。这些特征使RNAi成为美洲猪笼草基因功能研究中不可或缺的技术。
尽管已经报道了RNAi在 美洲猪 笼草功能基因研究中的应用,但没有详细或逐步的描述。本报告为 美洲蟑螂中的RNAi提供了一个分步操作指南,可用于其他蟑螂的基因功能研究。此外,本指南不仅限于Blattodea,还可以应用于许多其他昆虫,只需稍作修改即可。
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Protocol
P. americana的系列最初由Huiling Hao博士提供。该物种已经进行了30年的近亲繁殖9。
1. 美洲鹦鹉的孵化和投饲
- 收集美洲 鹦 鹉的新鲜卵母(产卵后立即),并在25°C和60%湿度的黑暗培养箱中孵育约25天。然后在孵化前3天将温度和湿度提高到30°C和75%。
- 使用具有4毫米孔径的筛子将孵化的若虫与卵形目分开。
- 将若虫保存在圆柱形容器(直径12厘米,高10厘米)中,在28°C,70%湿度的黑暗中。用凡士林刷容器的内边缘,以防止蟑螂逸出。提供老鼠的食物,水和住所(蛋盘)。注意若虫的活动,定期清理粪便和碎屑。
2. 选择适当幼虫的若虫
- 使用玻璃管挑出新鲜蜕皮 的美洲猪笼 草(体色为白色)。将它们保存在新的容器中,等待正确的处理阶段。
注意:在上述喂养条件下约19天后,3龄 的若虫将可用于注射。刚蜕皮的蟑螂的颜色是白色的,蟑螂通过蜕皮时间澄清了幼虫。
3.用T7启动子制备靶片段
- 以 美洲猪笼草 的cDNA为模板,设计成对的引物进行PCR,得到靶基因9的300-800 bp DNA片段。然后将PCR片段克隆到pTOPO载体中(参见 材料表)进行测序。
- 使用靶片段DNA作为模板,在5'末端合成一对具有T7启动子序列(5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3')的新引物,并进行另一轮PCR以获得每侧9上具有T7启动子的靶片段。
4. dsRNA的体外转录和合成
- 在反应体系中加入10μLT7 2X缓冲液,2μL酶混合物,T7表达(参见 材料表)和2μgPCR产物(在步骤3.2中获得),并将总体积加起来为20μL,ddH2O.手动轻轻倒置混合并在37°C下孵育30分钟和70°C孵育10分钟, 然后慢慢冷却到室温。
- 以1:200的比例用ddH2O稀释RNase A溶液(4μg/ μL)。然后向体系中加入1μLRQ1 RNase-free脱氧核糖核酸酶(1 U / μL)和1μL稀释的RNase A溶液(参见 材料表)。
注意:现在,单个系统的体积为 22 μL。 - 在37°C孵育30分钟。然后加入总体积的10%(同时进行N反应时,总体积为N×22μL)乙酸钠和三体积的总体积的异丙醇。
- 手动轻轻倒置混合,放在冰上5分钟,并在4°C下以13,000× g 离心10分钟。
- 用移液管除去上清液,用75%乙醇(用25%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水)洗涤残留物,然后在4°C下以13,000× g 离心5分钟。
- 再次取出上清液。在室温下风干沉淀15分钟。使用约100μLDEPC水溶解dsRNA,然后将dsRNA稀释至最终的2μg/ μL。
注意:dsRNA可以在-80°C下储存6个月。
5. 将 dsRNA 溶液上样到注射器中
- 提前在微量注射泵中设置程序(见 材料表),以确保每次注射的体积一致。在使用注射器之前,用DEPC水填充注射器8-10次来清洁注射器。
- 将10μL注射器安装在微量注射泵上,启动泵,并用10μLdsRNA溶液填充注射器(在步骤4.6中制备)。将1μLdsRNA注入3龄 若虫(见步骤2),并确保它不会泄漏到体内。
6. 将 dsRNA 注射到 美洲猪笼草中
- 用容器中增加的CO2 浓度麻醉蟑螂,直到蟑螂不再移动,然后立即进行注射。
- 用镊子轻轻拿起蟑螂,用手将蟑螂送到针上。接下来, 通过 两个腹部索米特之间的间隙水平插入针头,以对抗表皮。关于插入深度,越浅越好。
- 然后,将dsRNA溶液注入蟑螂体内。最后,拔出针尖。确保针尖尽可能靠近表皮,以避免损伤内脏器官。
注意:注射应在解剖显微镜下进行。 - 将注射的蟑螂放入干净的生物测定容器中。等待约10-20分钟,让它们从CO2 效应中恢复过来。用注射日期,dsRNA的类型和剂量以及 美洲猪笼草的年龄标记容器。
- 将注射的蟑螂置于28°C,70%湿度的黑暗环境中,提供水,饲料和庇护所,并定期观察蟑螂表型的可能变化。
7. 敲低确认和表型分析
- 使用任何可用的分子生物学技术(如定量实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 和蛋白质印迹)评估 RNAi 的效率。有关详细的 qRT-PCR 和蛋白质印迹程序,请参见参考文献1,12。
- 要观察和分析RNAi相关表型,请使用适用于活体动物的显微镜。
注意:RNAi可能会影响蟑螂的形态,行为,蜕皮,肢体再生和其他生理活动。表型的比频是根据具体条件计算的。
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Representative Results
图1 显示了成功的注射。带有微直径针头的显微注射注射器应水平放置在加强器上(图1A)。针 通过 两个腹部索米特之间的间隙水平插入表皮(图1B)。确保液体进入 美洲猪笼 草腹部。针头太陡峭的角度会损害内脏器官(图1C),注射不当导致dsRNA溶液从腹部泄漏出来(图1D)。如果有任何dsRNA泄漏出来,则需要丢弃动物,并进行另一次注射。美洲 猪笼草 在注射过程中需要完全麻醉。
像其他生物实验一样,在进行RNAi治疗时需要对照组。治疗差异需要确认是由靶向RNAi引起的,而不是由于dsRNA的脱靶效应,注射过程中的损伤或CO2麻醉引起的。这里选取Ddc(多巴脱羧酶)和Dpp(十五变性)基因作为两个实例,观察dsRNA注射后蟑螂蟑螂的表型,并将动物中没有靶标的阴性对照dsMock11作为阴性对照,通过qRT-PCR检测RNAi效率(图2)。以注射ds Ddc为例(图3A,B),由于黑色素化被阻断,具有敲低Ddc基因的美洲疟原虫将长期具有白色表皮(图3B)。在肢体再生所必需的dsDpp注射实验中,RNAi破坏了肢体再生(图4),这是先前报道的9。
图1:仪器和正确的注射操作。 (A)显微注射器械上的注射器。(二)注射针的正确位置;没有液体出来。(C)注射针角度太陡,可能会损害内脏器官。(D)注射失败导致dsRNA溶液或血淋巴液流出。 请点击此处查看此图的大图。
图2:通过qRT-PCR检测RNAi效率。 采用qRT-PCR检测 Ddc 和 Dpp 基因的敲低效率,以dsMock 为阴性对照。每次处理使用三个重复,误差线表示三个重复的标准偏差。通过学生的t检验分析了差异的意义。*: P < 0.05, **: P < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
图3:成功RNAi破坏美洲猪笼草表皮黑化的例子(A)注射dsMock后正常蟑螂具有正常黑色化。(B)Ddc RNAi介导的白化病性美洲猪笼草蜕皮后。请点击此处查看此图的大图。
图4:成功破坏美洲猪笼草肢体再生的实例。(A)后腿截肢的美洲猪(B-C)美洲猪在RNAi治疗和蜕皮后成功破坏肢体再生的例子。后腿在dsMock对照组(B)中再生,但当Dpp(C)基因沉默时没有。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该报告描述了 美洲猪笼草的方法学循序渐进的RNAi策略;值得注意的是,它也可以应用于其他蟑螂(例如Blattella germanica )和许多其他变化很小的昆虫。然而,RNAi的基因沉默效率并不总是足够高,与基因敲除策略13相比,存在明显的劣势。基因水平的以下残留效应可能会干扰真正的表型。为了确保RNAi治疗的成功,需要考虑几个基本条件,包括动物的身体状况,对照组的选择,dsRNA分子的长度和浓度,避免脱靶效应(OTE)的可能性,以及组织对dsRNA的不同敏感性。
美洲猪笼草的身体状况
健康的动物是RNAi和 美洲猪笼草不同基因功能研究成功的前提。此外,为了保持实验的一致性,只选择在相同条件下饲养的蟑螂。只有比3龄 龄(孵化后约19天)的若虫才能使用,因为年轻的若虫在体型上太小而无法注射。
对照组的选择
dsMock11 和dsEGFP 以及相同剂量的蟑螂盐水6 已被用作阴性对照。阴性对照的靶序列应该是外源性的,与内源性基因序列11没有同源性。dsMock 是首选,因为使用dsEGFP 会在一定程度上延迟 美洲猪笼草 的生长和发育。
dsRNA 长度
RNAi的效率受dsRNA分子长度的影响。较长的dsRNA片段在mRNA沉默时更有效,可能是因为它产生更多的siRNA,或者较短的dsRNA片段被细胞吸收效率较低 1。在P. americana 和 B. germanica中,300 bp至800 bp之间的dsRNA似乎是RNAi实验6,9,10,14的理想选择。短的dsRNA可能不足以诱导全身RNAi反应,而长dsRNA可能会增加OTE风险1。
dsRNA浓度
dsRNA的浓度也会影响RNAi1,15的效率。对于美洲猪笼草的3龄若虫,1μg的dsRNA似乎是一个合理的量,4-6μg适用于成体的6,9,14,16。用于注射的精确dsRNA量可以根据美洲猪笼草的基因,组织和体型进行调整。
脱靶效应
RNAi的OTE总共很难避免17,18。可以设计dsRNA的两个非重叠区域来减少OTE对表型5的影响。如果靶向两个不同区域的dsRNA产生相同的效果,则可以排除OTE诱导的假阳性现象的可能性。
一种RNAi效率检测方法
表型分析是评估RNAi的最直观方法,qRT-PCR和蛋白质印迹分析是测量敲低效率的两个黄金标准。qRT-PCR是测定mRNA水平6,9,10干扰效率的直接方法。引物应设计在dsRNA靶向区域之外。蛋白质印迹分析是分析蛋白质水平干扰的另一种方法,但需要特异性抗体。然而,有时没有观察到特定的表型效应,即使具有很高的沉默效率(>90%)。这种残留效应的一种可能的解释是蟑螂的基因家族大规模扩张;基因的冗余控制着许多特定的功能和表型。另一种可能的解释是,功能足够多所需的最低基因表达水平极低。这些导致即使具有足够高的RNAi效率也无法获得特定的表型。
RNAi 敏感性的组织特异性
一些蟑螂组织(如卵巢和副腺)的干扰效率不够高,这可能是dsRNA5,19的穿透屏障;还观察到不同昆虫物种中不同的RNAi功效,这取决于血淋巴15,20中dsRNA的酶降解。一些想法对于提高 美洲疟原 虫组织中的RNAi效率是合理的,例如 在体外21中将dsRNA消化成siRNA,增加dsRNA剂量和注射时间,以及使用纳米材料作为递送载体。
总之,RNAi的高效率以及注释良好的基因组序列9 使 P. americana 成为在广泛的发育,生理和行为研究中研究基因功能的良好模型。同样,这份报告可以作为其他对dsRNA敏感且难以进行敲除突变的昆虫的宝贵参考。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金(32070500、31330072 31620103917、31572325、广东省自然科学基金(批准号:2021B1515020044和2020A1515011267)、广东省科学技术厅(批准号:2019B090905003和2019A0102006)、广州市科学技术厅(批准号:202102020110号)资助, 获深圳市科技计划(助学金编号:KQTD20180411143628272 to Sh.L.)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
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