Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Richtlinien für die RNAi-Operationstechniken in P. americana.
Abstract
Kakerlaken, ein Hygieneschädling, sind aufgrund ihrer einfachen Fütterung und ihrer hemimetabolen Eigenschaften essentielle Arten in Insektenentwicklungs- und metamorphen Studien. Insgesamt haben diese Vorteile mit gut annotierten Genomsequenzen die amerikanische Kakerlake Periplaneta americana zu einem wichtigen hemimetabolen Insektenmodell gemacht. Begrenzt durch den Mangel an Knockout-Strategie wird effektiver RNA-Interferenz (RNAi)-basierter Gen-Knockdown zu einer unverzichtbaren Technik in der funktionellen Genforschung von P. americana. Das vorliegende Protokoll beschreibt die RNAi-Operationstechniken in P. americana. Das Protokoll umfasst (1) die Auswahl des P. americana in den richtigen Entwicklungsstadien, (2) die Vorbereitung auf die Injektionseinstellung, (3) die dsRNA-Injektion und (4) die Erkennung der Gen-Knockdown-Effizienz. RNAi ist ein mächtiges umgekehrtes genetisches Werkzeug in P. americana. Die Mehrheit der P. americana-Gewebe ist empfindlich gegenüber extrazellulärer dsRNA. Seine Einfachheit ermöglicht es Forschern, schnell dysfunktionale Phänotypen unter einer oder mehreren gezielten dsRNA-Injektionen zu erhalten, so dass Forscher das P. americana besser für Entwicklungs- und metamorphe Studien verwenden können.
Introduction
RNA-Interferenz (RNAi), ein evolutionär konservierter Mechanismus, wird allmählich zu einem essentiellen reverse-genetischen Werkzeug, um die Genexpression in vielen Organismen zu hemmen1, seit Andrew Fire und Craig Mello2 die doppelsträngige RNA (dsRNA) vermittelte Genstillestrategie entwickelt haben. dsRNA wird durch das Enzym Dicer in Zellen in Fragmente von 21-23 Nukleotiden, kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), gespalten, um den RNAi-Signalweg zu aktivieren. Dann werden siRNAs in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, der an die Ziel-mRNA koppelt, eine mRNA-Spaltung verursacht und schließlich zum Verlust der Genfunktion 3,4,5 führt. Unter den Insektenarten wurden bisher viele systemische RNAi-Experimente in vielen Insektenordnungen berichtet, wie Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera und Blattodea 5,6,7,8.
Kakerlaken (Blattaria) sind eine essentielle Insektenfamilie in Entwicklungs- und metamorphen Studien mit ihren schnellen Wachstumszyklen, ihrer starken Anpassungsfähigkeit an die Umwelt und ihrer hohen Entwicklungsplastizität9. Bevor entdeckt wurde, dass RNAi mit Kakerlaken kompatibel war, konzentrierte sich die bisherige Forschung nur auf die Prävention und Kontrolle von Kakerlaken aufgrund einer Knappheit genetischer Manipulationstechniken bei Kakerlaken. Die einzigartige Struktur der Kakerlaken-Oothek machte es schwierig, einen auf Embryoneninjektionen basierenden Gen-Knockout mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Außerdem zeigen die meisten Gewebe in Kakerlaken (wie P. americana) eine robuste systemische RNAi-Reaktion, die die schnelle Erzeugung dysfunktionaler Phänotypen durch Injektion einer oder mehrerer Ziel-dsRNAs 9,10,11 ermöglicht. Diese Eigenschaften machten RNAi zu einer unverzichtbaren Technik in der Genfunktionsforschung bei P. americana.
Obwohl über die Verwendung von RNAi in der funktionellen Genforschung in P. americana berichtet wurde, war keine detaillierte oder Schritt-für-Schritt-Beschreibung verfügbar. Dieser Bericht enthält eine Schritt-für-Schritt-Betriebsleitlinie für RNAi in P. americana, die für die Genfunktionsstudie bei anderen Kakerlaken nützlich ist. Darüber hinaus ist dieser Leitfaden nicht auf Blattodea beschränkt und kann mit geringfügigen Modifikationen auf viele andere Insekten angewendet werden.
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Protocol
Die Linie von P. americana wurde ursprünglich von Dr . Huiling Hao zur Verfügung gestellt. Diese Art wird seit 30 Jahren mit Inzuchtgepflegt 9.
1. Schlüpfen und Fütterung von P. americana
- Sammeln Sie frische Otheken (unmittelbar nach der Eiablage) von P. americana und inkubieren Sie im dunklen Inkubator bei 25 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit für ~ 25 Tage. Dann erhöhen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf 30 ° C und 75% 3 Tage vor dem Schlüpfen.
- Verwenden Sie ein Sieb mit 4 mm Öffnung, um die geschlüpften Nymphen von den Ootheken zu trennen.
- Bewahren Sie die Nymphen in zylindrischen Behältern (12 cm Durchmesser und 10 cm Höhe) im Dunkeln bei 28 °C, 70% Luftfeuchtigkeit auf. Bürsten Sie den Innenrand der Behälter mit Vaseline, um zu verhindern, dass Kakerlaken entkommen. Stellen Sie Rattenfutter, Wasser und Schutz (Eierschalen) zur Verfügung. Achten Sie auf die Aktivität der Nymphen und reinigen Sie regelmäßig den Kot und die Trümmer.
2. Auswahl der Nymphen im richtigen Stadium
- Verwenden Sie eine Glasröhre, um die frisch gehäutete P. americana (weiße Körperfarbe) herauszupicken. Bewahren Sie sie in neuen Behältern auf und warten Sie auf die richtige Phase der Behandlung.
HINWEIS: Nach ~ 19 Tagen unter den oben genannten Fütterungsbedingungen stehen die Nymphen in den3. Stadien zur Injektion zur Verfügung. Die Farbe von frisch gehäuteten Kakerlaken ist weiß, und die Stadien werden durch Häutungszeiten geklärt.
3. Vorbereitung des Zielfragments mit T7-Promotoren
- Unter Verwendung der cDNA von P. americana als Vorlage entwerfen Sie gepaarte Primer zur Durchführung einer PCR, um ein DNA-Fragment von 300-800 bp des Zielgens9 zu erhalten. Klonen Sie dann das PCR-Fragment zur Sequenzierung in einen pTOPO-Vektor (siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie die Zielfragment-DNA als Vorlage, synthetisieren Sie ein neues Paar Primer mit T7-Promotorsequenz (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') an den 5'-Terminals und führen Sie eine weitere Runde PCR durch, um das Zielfragment mit T7-Promotoren auf jeder Seite9 zu erhalten.
4. Transkription und Synthese von dsRNA in vitro
- 10 μL T7 2X Puffer, 2 μL der Enzymmischung, T7 Express (siehe Materialtabelle) und 2 μg PCR-Produkt (erhalten in Schritt 3.2) in das Reaktionssystem geben und das Gesamtvolumen auf 20 μL mit ddH2O addieren. Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen und bei 37 °C für 30 min und 70 °C für 10 min inkubieren, und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen.
- Verdünnen Sie RNase A-Lösung (4 μg/μL) mit ddH 2 O im Verhältnis 1:200. Dann fügen Sie dem System 1 μL RQ1 RNase-freie DNase (1 U/μL) und 1 μL verdünnte RNase A-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Jetzt beträgt das Volumen eines einzelnen Systems 22 μL. - 30 min bei 37 °C inkubieren Dann fügen Sie 10% des Gesamtvolumens (bei gleichzeitiger Durchführung von N-Reaktionen beträgt das Gesamtvolumen N x 22 μL) Natriumacetat und drei Volumina des Gesamtvolumens von Isopropanol hinzu.
- Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen, 5 min auf Eis legen und 10 min bei 4 °C bei 13.000 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, waschen Sie den Rückstand mit 75% Ethanol (mit 25% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser) und zentrifugieren Sie dann bei 13.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand wieder. Trocknen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft. Verwenden Sie ~ 100 μL DEPC-Wasser, um dsRNA aufzulösen, und verdünnen Sie dann die dsRNA auf die letzten 2 μg / μL.
HINWEIS: Die dsRNA konnte 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.
5. Laden der dsRNA-Lösung in die Spritze
- Richten Sie das Programm in der Mikroinjektionspumpe (siehe Materialtabelle) im Voraus ein, um sicherzustellen, dass das Volumen jeder Injektion konsistent ist. Bevor Sie die Spritze verwenden, reinigen Sie die Spritze, indem Sie sie 8-10 Mal mit DEPC-Wasser füllen.
- Installieren Sie die 10-μL-Spritze auf der Mikroinjektionspumpe, starten Sie die Pumpe und füllen Sie die Spritze mit 10 μL dsRNA-Lösung (hergestellt in Schritt 4.6). Injizieren Sie 1 μL der dsRNA in eine Nymphe im 3. Stadium (siehe Schritt 2) und stellen Sie sicher, dass sie nicht in den Körper austritt.
6. Injektion von dsRNA in P. americana
- Betäuben Sie die Kakerlaken mit einer erhöhten Konzentration von CO2 in einem Behälter, bis sich die Kakerlaken nicht mehr bewegen, und fahren Sie dann sofort mit der Injektion fort.
- Nehmen Sie die Kakerlake vorsichtig mit einer Pinzette auf und bringen Sie die Kakerlake mit der Hand in Richtung Nadel. Als nächstes führen Sie die Nadel über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis ein. Über die Einfügetiefe gilt: Je flacher, desto besser.
- Dann injizieren Sie die dsRNA-Lösung in die Kakerlake. Zum Schluss die Nadelspitze herausziehen. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadelspitze so nah wie möglich an der Epidermis befindet, um eine Schädigung der inneren Organe zu vermeiden.
HINWEIS: Die Injektion sollte unter einem Dissektionsmikroskop erfolgen. - Geben Sie die injizierten Kakerlaken in saubere Bioassay-Behälter. Warten Sie etwa 10-20 Minuten, damit sie sich von den CO 2-Effekten erholen können. Beschriften Sie die Behälter mit dem Injektionsdatum, der Art und der Dosis der dsRNA sowie dem Alter der P. americana.
- Legen Sie die injizierten Kakerlaken in eine dunkle Umgebung bei 28 ° C, 70% Luftfeuchtigkeit, liefern Sie Wasser, Futter und Schutz und beobachten Sie mögliche Veränderungen im Phänotyp der Kakerlaken regelmäßig.
7. Knockdown-Bestätigung und phänotypische Analyse
- Bewerten Sie die Effizienz von RNAi mit allen verfügbaren molekularbiologischen Techniken wie quantitativer Real-Time PCR (qRT-PCR) und Western Blotting. Für detaillierte qRT-PCR- und Western-Blotting-Verfahren siehe Referenzen 1,12.
- Um RNAi-bezogene Phänotypen zu beobachten und zu analysieren, verwenden Sie das für lebende Tiere geeignete Mikroskop.
HINWEIS: RNAi kann die Morphologie, das Verhalten, die Häutung, die Regeneration der Gliedmaßen und andere physiologische Aktivitäten von Kakerlaken beeinflussen. Die spezifische Häufigkeit des Phänotyps wird nach bestimmten Bedingungen berechnet.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine erfolgreiche Injektion. Die Mikroinjektionsspritze mit einer Mikrodurchmessernadel sollte horizontal auf den Booster gelegt werden (Abbildung 1A). Die Nadel wird über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis eingeführt (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in den Bauch von P. americana gelangt. Der zu steile Winkel der Nadel schädigt die inneren Organe (Abbildung 1C), und eine unsachgemäße Injektion führt zu einem Austritt der dsRNA-Lösung aus dem Bauch (Abbildung 1D). Wenn eine dsRNA austritt, muss das Tier entsorgt werden, und eine weitere Injektion wird durchgeführt. Das P. americana muss während der Injektion vollständig betäubt werden.
Wie bei anderen biologischen Experimenten werden Kontrollgruppen benötigt, wenn eine RNAi-Behandlung durchgeführt wird. Die Behandlungsunterschiede müssen durch gezielte RNAi bestätigt werden, anstatt aufgrund der Off-Target-Effekte von dsRNA, der Schädigung während der Injektion oder der CO 2-Anästhesie. Hier wurden Ddc (Dopa decarboxylase) und Dpp (decapentaplegic) Gene als zwei Beispiele ausgewählt, um den Phänotyp der gehäuteten Kakerlaken nach dsRNA-Injektion zu beobachten, und eine Negativkontrolle dsMock11, die kein Ziel in den Tieren hat, wurde als Negativkontrolle durchgeführt, die RNAi-Effizienz wurde durch qRT-PCR nachgewiesen (Abbildung 2). Am Beispiel der Injektion von dsDdc (Abbildung 3A,B) hätte die P. americana mit niedergeschlagenem Ddc-Gen die weiße Epidermis für eine lange Zeit, da die Melanisierung blockiert ist (Abbildung 3B). Im Experiment mit dsDpp-Injektionen, die für die Regeneration der Gliedmaßen notwendig sind, störte die RNAi die Regeneration der Gliedmaßen (Abbildung 4), über die zuvorberichtet wurde 9.
Abbildung 1: Instrument und korrekte Injektionsbedienung . (A) Die Spritze auf dem Mikroinjektionsinstrument. b) die richtige Position der Injektionsnadel; Es kommt keine Flüssigkeit heraus. (C) Der zu steile Winkel der Injektionsnadel kann die inneren Organe beschädigen. (D) Eine fehlgeschlagene Injektion führt dazu, dass die dsRNA-Lösung oder die Hämolymphe ausströmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: RNAi-Effizienz durch qRT-PCR nachgewiesen. Die Knockdown-Effizienz von Ddc- und Dpp-Genen wurde durch qRT-PCR nachgewiesen, und der dsMock wurde als Negativkontrolle verwendet. Für jede Behandlung wurden drei Replikate verwendet, und die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der drei Replikate an. Die Bedeutung von Unterschieden wurde durch den t-Test von Student analysiert. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Beispiele für erfolgreiche RNAi zur Störung der Epidermis-Melanisierung in P. americana. (A) Normale Kakerlake nach Injektion vondsMock mit normaler Melanisierung. (B) Ddc RNAi vermittelte albinistische P. americana nach der Häutung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Beispiele für erfolgreiche RNAi zur Störung der Regeneration von Gliedmaßen bei P. americana. (A) A P. americana mit amputiertem Hinterbein. (B-C) P. americana nach RNAi-Behandlungen und Häutung. Das Hinterteil wurde in der ds Mock-Kontrollgruppe (B) regeneriert, aber nicht, als das Dpp (C)-Gen zum Schweigen gebracht wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieser Bericht beschrieb eine methodische Schritt-für-Schritt-RNAi-Strategie in P. americana; Bemerkenswert ist, dass es auch auf andere Kakerlaken (Blattella germanica, zum Beispiel) und viele andere Insekten mit geringfügigen Veränderungen angewendet werden kann. Die Gen-Silencing-Effizienz von RNAi ist jedoch nicht immer hoch genug, mit einem offensichtlichen Nachteil gegenüber der Gen-Knockout-Strategie13. Der folgende Resteffekt der Genebene kann die realen Phänotypen stören. Um sicherzustellen, dass die RNAi-Behandlung erfolgreich ist, müssen mehrere wesentliche Bedingungen berücksichtigt werden, einschließlich der körperlichen Verfassung der Tiere, der Auswahl der Kontrollgruppe, der Länge und Konzentration der dsRNA-Moleküle, der Vermeidung der Möglichkeit von Off-Target-Effekten (OTE) und der unterschiedlichen Empfindlichkeit von Geweben gegenüber dsRNA.
Körperliche Verfassung von P. americana
Gesunde Tiere sind die Voraussetzung für den Erfolg von RNAi und verschiedenen Genfunktionsstudien bei P. americana. Außerdem, um Experimente konsistent zu halten, werden nur Kakerlaken ausgewählt, die unter den gleichen Bedingungen aufgezogen wurden. Und nur Nymphen, die älter als das 3. Stadium sind (ca. 19 Tage nach dem Schlüpfen), können verwendet werden, da jüngere Nymphen zu klein für eine Injektion in Körpergrößesind.
Auswahl der Kontrollgruppe
dsMock11 und dsEGFP und die gleiche Dosis Kakerlakenkochsalzlösung6 wurden als Negativkontrollen verwendet. Die Zielsequenzen von Negativkontrollen sollten exogen sein und keine Homologie mit der endogenen genetischen Sequenz11 aufweisen. dsMock wurde bevorzugt, weil die Verwendung von dsEGFP das Wachstum und die Entwicklung von P. americana bis zu einem gewissen Grad verzögern würde.
dsRNA-Länge
Die Effizienz von RNAi wird durch die Länge der dsRNA-Moleküle beeinflusst. Längere dsRNA-Fragmente sind beim mRNA-Silencing effektiver, möglicherweise weil sie mehr siRNAs produzieren, oder kürzere dsRNA-Fragmente werden von Zellen weniger effizient aufgenommen 1. Bei P. americana und B. germanica erscheint dsRNA zwischen 300 bp und 800 bp ideal für RNAi-Experimente 6,9,10,14. Eine kurze dsRNA kann nicht ausreichen, um eine systemische RNAi-Antwort zu induzieren, während eine lange dsRNA das OTE-Risiko erhöhen kann1.
dsRNA-Konzentration
Die Konzentration von dsRNA kann auch die Effizienz von RNAi 1,15 beeinflussen. Für die Nymphen von P. americana im 3. Stadium scheint 1 μg dsRNA eine angemessene Menge zu sein, und 4-6 μg ist für erwachsene 6,9,14,16 geeignet. Die genaue dsRNA-Menge, die für die Injektion verwendet wird, kann basierend auf den Genen, Geweben und der Körpergröße des P. americana angepasst werden.
Off-Target-Effekte
Die OTE von RNAi ist schwer zu vermeideninsgesamt 17,18. Zwei nicht überlappende Regionen der dsRNA können entworfen werden, um die Wirkung von OTE auf die Phänotypen5 zu reduzieren. Wenn dsRNAs, die auf zwei verschiedene Regionen abzielen, den gleichen Effekt erzeugen, könnte die Möglichkeit eines OTE-induzierten falsch positiven Phänomens ausgeschlossen werden.
Methode zur RNAi-Effizienzdetektion
Die phänotypische Analyse ist der intuitivste Ansatz zur Bewertung von RNAi, und qRT-PCR und Western Blotting Analysis sind die beiden goldenen Standards zur Messung der Knockdown-Effizienz. qRT-PCR ist eine einfache Methode zur Bestimmung der Interferenzeffizienz auf mRNA-Ebene6,9,10. Die Primer sollten aus der dsRNA-Zielregion heraus entworfen werden. Die westliche Blotting-Analyse ist eine weitere Methode zur Analyse von Interferenzen auf Proteinebene, erfordert jedoch spezifische Antikörper. Allerdings werden manchmal keine besonderen phänotypischen Effekte beobachtet, selbst bei hoher Schalldämpfungseffizienz (>90%). Eine mögliche Erklärung für diesen Resteffekt ist eine massive Genfamilienerweiterung bei Kakerlaken; Die Redundanzen von Genen steuern viele bestimmte Funktionen und Phänotypen. Eine andere mögliche Erklärung ist, dass das minimale Gen-Expressionsniveau, das für funktionell genug erforderlich ist, extrem niedrig ist. Diese führen dazu, dass ein bestimmter Phänotyp auch bei ausreichend hoher RNAi-Effizienz nicht erhalten werden kann.
Gewebespezifität für die RNAi-Sensitivität
Die Interferenzeffizienz in einigen Kakerlakengeweben (wie dem Eierstock und den akzessorischen Drüsen) ist nicht hoch genug, was die durchdringende Barriere für dsRNA 5,19 sein könnte; Es wird auch die unterschiedliche RNAi-Wirksamkeit in verschiedenen Insektenarten beobachtet, die vom enzymatischen Abbau von dsRNA in Hämolymphe15,20 abhängt. Einige Ideen sind vernünftig, um die RNAi-Effizienz in P. americana-Geweben zu verbessern, wie z.B. die Verdauung von dsRNA in siRNAs in vitro21, die Erhöhung der dsRNA-Dosis und Injektionszeiten und die Verwendung von Nanomaterialien als Träger für die Abgabe.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hohe Effizienz von RNAi zusammen mit gut annotierten Genomsequenzen9 P. americana zu einem guten Modell für die Untersuchung der Genfunktion in einer Vielzahl von Entwicklungs-, physiologischen und Verhaltensstudien macht. In ähnlicher Weise kann dieser Bericht als wertvolle Referenz für andere Insekten dienen, die empfindlich auf dsRNA reagieren und schwer zu machende Knockout-Mutationen sind.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 und 31572325 to C.R., Sh.L.), von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 und 2020A1515011267 to C.R.), vom Department of Science and Technology in Guangdong Province (Grant Nos. 2019B090905003 und 2019A0102006), vom Department of Science and Technology in Guangzhou (Grant No. 202102020110), durch das Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 bis Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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