Summary
Den nuværende protokol beskriver trinvise retningslinjer for RNAi-operationsteknikkerne i P. americana.
Abstract
Kakerlakker, et sanitært skadedyr, er vigtige arter i insektudviklingsmæssige og metamorfe undersøgelser på grund af deres lette fodring og hemimetaboløse egenskaber. Alt i alt med velkommenterede genomsekvenser har disse fordele gjort amerikansk kakerlak, Periplaneta americana, til en vigtig hemimetaboløs insektmodel. Begrænset af manglen på knockout-strategi bliver effektiv RNA-interferens (RNAi)-baseret gennedslag en uundværlig teknik i funktionel genforskning af P. americana. Den nuværende protokol beskriver RNAi-operationsteknikkerne i P. americana. Protokollen omfatter (1) udvælgelse af P. americana på korrekte udviklingsstadier, (2) forberedelse til injektionsindstillingen, (3) dsRNA-injektion og (4) påvisning af gennedslagseffektivitet. RNAi er et kraftfuldt omvendt genetisk værktøj i P. americana. Størstedelen af P. americana-væv er følsomme over for ekstracellulært dsRNA. Dens enkelhed gør det muligt for forskere hurtigt at opnå dysfunktionelle fænotyper under en eller flere målrettede dsRNA-injektioner, hvilket gør det muligt for forskere bedre at bruge P. americana til udviklingsmæssige og metamorfe undersøgelser.
Introduction
RNA-interferens (RNAi), en evolutionært bevaret mekanisme, bliver gradvist et vigtigt omvendt genetisk værktøj til at hæmme genekspression i mange organismer1, da Andrew Fire og Craig Mello2 udviklede den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) medierede gensindsigtsstrategi. dsRNA spaltes i fragmenter af 21-23 nukleotider, små interfererende RNA'er (siRNA'er), af enzymet Dicer i celler for at aktivere RNAi-vejen. Derefter inkorporeres siRNA'er i det RNA-inducerede hæmningskompleks (RISC), som kobles til mål-mRNA'et, forårsager mRNA-spaltning og resulterer til sidst i tab af genfunktion 3,4,5. Blandt insektarterne er mange systemiske RNAi-eksperimenter hidtil blevet rapporteret i masser af insektordrer, såsom Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera og Blattodea 5,6,7,8.
Kakerlakker (Blattaria) er en essentiel insektfamilie i udviklingsmæssige og metamorfe studier med deres hurtige vækstcyklusser, stærke tilpasningsevne til miljøet og høj udviklingsmæssig plasticitet9. Før man opdagede, at RNAi var kompatibel med kakerlakker, fokuserede tidligere forskning kun på kakerlakforebyggelse og -kontrol på grund af mangel på genetiske manipulationsteknikker i kakerlakker. Kakerlak oothecas unikke struktur gjorde det udfordrende at udføre embryoinjektionsbaseret genknockout med CRISPR-Cas9-systemet. Desuden viser de fleste væv i kakerlakker (såsom P. americana) robust systemisk RNAi-respons, hvilket muliggør hurtig generering af dysfunktionelle fænotyper ved at injicere en eller flere målrettede dsRNA'er 9,10,11. Disse funktioner gjorde RNAi til en uundværlig teknik inden for genfunktionel forskning i P. americana.
Selvom brugen af RNAi i funktionel genforskning i P. americana er blevet rapporteret, var der ingen detaljeret eller trinvis beskrivelse tilgængelig. Denne rapport giver en trinvis operationel retningslinje for RNAi i P. americana, der er nyttig til genfunktionsundersøgelse i andre kakerlakker. Desuden er denne vejledning ikke begrænset til Blattodea og kan anvendes på mange andre insekter med mindre ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Linjen af P. americana blev oprindeligt leveret af Dr. Huiling Hao. Denne art er blevet opretholdt med indavl i 30 år9.
1. Udklækning og fodring af P. americana
- Saml frisk oothecae (umiddelbart efter æglægning) af P. americana og inkuber i den mørke inkubator ved 25 ° C og 60% fugtighed i ~ 25 dage. Derefter øges temperaturen og fugtigheden til 30 °C og 75 % 3 dage før udklækningen.
- Brug en sigte med 4 mm blænde til at adskille de udklækkede nymfer fra oothecae.
- Opbevar nymferne i cylindriske beholdere (12 cm i diameter og 10 cm i højden) i mørke ved 28 °C, 70 % fugtighed. Børst den indvendige kant af beholderne med vaselin for at forhindre kakerlakker i at undslippe. Giv rottefoder, vand og husly (æggebakker). Vær opmærksom på nymfernes aktivitet og rengør regelmæssigt afføring og snavs.
2. Udvælgelse af nymferne i korrekt instar
- Brug et glasrør til at udvælge den frisksmeltede P. americana (hvid i kropsfarve). Opbevar dem i nye beholdere og vent på det rigtige stadium til behandling.
BEMÆRK: Efter ~19 dage under ovennævnte fodringsbetingelser vil nymferne i 3. instars være tilgængelige til injektion. Farven på frisksmeltede kakerlakker er hvid, og instars afklares ved smeltetider.
3. Udarbejdelse af målfragmentet med T7-initiativtagere
- Ved hjælp af cDNA af P. americana som skabelon designer parrede primere til at udføre PCR for at opnå 300-800 bp DNA-fragment af målgenet9. Klon derefter PCR-fragmentet til en pTOPO-vektor (se materialetabel) til sekventering.
- Brug målfragmentet DNA som skabelon til at syntetisere et nyt par primere med T7-promotorsekvens (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') ved 5'-terminalerne og udføre en anden runde PCR for at opnå målfragmentet med T7-promotorer på hver side9.
4. Transkription og syntese af dsRNA in vitro
- Der tilsættes 10 μL T7 2X-buffer, 2 μL af enzymblandingen, T7 Express (se materialetabellen) og 2 μg PCR-produkt (opnået i trin 3.2) i reaktionssystemet, og det samlede volumen tilsættes til 20 μL med ddH2 O. Blandes forsigtigt på hovedetmanuelt og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter og 70 °C i 10 minutter og derefter langsomt afkøles til stuetemperatur.
- Fortynd RNase A-opløsning (4 μg/μL) medddH20i et forhold på 1:200. Derefter tilsættes 1 μL RQ1 RNase-fri DNase (1 U/μL) og 1 μL fortyndet RNase A-opløsning til systemet (se materialetabel).
BEMÆRK: Nu er volumenet af et enkelt system 22 μL. - Inkuber ved 37 °C i 30 min. Derefter tilsættes 10% af det samlede volumen (når der udføres N-reaktioner samtidigt, er det samlede volumen N x 22 μL) natriumacetat og tre volumener af det samlede volumen isopropanol.
- Bland forsigtigt på hovedet manuelt, læg det på is i 5 minutter og centrifuger ved 13.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten med en pipette, vask resten med 75% ethanol (med 25% diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlet vand) og centrifuger derefter ved 13.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatant igen. Lufttør pillen i 15 minutter ved stuetemperatur. Brug ~ 100 μL DEPC-vand til at opløse dsRNA, fortynd derefter dsRNA'et til de endelige 2 μg / μL.
BEMÆRK: DSRNA'et kan opbevares ved -80 °C i 6 måneder.
5. Ilægning af dsRNA-opløsning i sprøjten
- Konfigurer programmet i mikroindsprøjtningspumpen (se materialetabellen) på forhånd for at sikre, at volumenet af hver injektion er konsistent. Før du bruger sprøjten, skal du rengøre sprøjten ved at fylde den med DEPC-vand 8-10 gange.
- Installer 10 μL-sprøjten på mikroinjektionspumpen, start pumpen, og fyld sprøjten med 10 μL dsRNA-opløsning (fremstillet ved trin 4.6). Injicer 1 μL af dsRNA'et i en 3. instarnymfe (se trin 2) og sørg for, at den ikke lækker ud til kroppen.
6. Injektion af dsRNA til P. americana
- Bedømme kakerlakkerne med en øget koncentration af CO2 i en beholder, indtil kakerlakkerne ikke bevæger sig mere, og fortsæt derefter straks med injektionen.
- Tag forsigtigt kakerlakken op med en pincet, og før kakerlakken mod nålen med hånden. Indsæt derefter nålen via mellemrummet mellem to abdominale somitter vandret mod epidermis. Om indsatsdybde, jo lavere, jo bedre.
- Derefter injiceres dsRNA-opløsningen i kakerlakken. Til sidst skal du trække nålespidsen ud. Sørg for, at nålespidsen er så tæt som muligt på epidermis for at undgå at beskadige indre organer.
BEMÆRK: Injektionen skal foretages under et dissektionsmikroskop. - Sæt de injicerede kakerlakker i rene bioassaybeholdere. Vent i ca. 10-20 minutter for at lade dem komme sig efter CO2 - effekterne. Mærk beholderne med injektionsdatoen, typen og dosis af dsRNA og alderen på P. americana.
- Placer de injicerede kakerlakker i et mørkt miljø ved 28 ° C, 70% fugtighed, sørg for vand, foder og husly, og observer regelmæssigt mulige ændringer i kakerlakkernes fænotype.
7. Knockdown bekræftelse og fænotypisk analyse
- Evaluer effektiviteten af RNAi ved hjælp af alle tilgængelige molekylærbiologiske teknikker såsom kvantitativ Real-Time PCR (qRT-PCR) og Western blotting. For detaljerede qRT-PCR- og Western blotting-procedurer, se Referencer 1,12.
- For at observere og analysere RNAi-relaterede fænotyper skal du bruge mikroskopet, der er egnet til levende dyr.
BEMÆRK: RNAi kan påvirke morfologi, adfærd, smeltning, lemmer regenerering og andre fysiologiske aktiviteter af kakerlakker. Den specifikke frekvens af fænotype beregnes efter specifikke forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en vellykket injektion. Mikroinjektionssprøjten med en nål med mikrodiameter skal placeres vandret på boosteren (figur 1A). Nålen indsættes via mellemrummet mellem to abdominale somitter vandret mod epidermis (figur 1B). Sørg for, at væsken går ind i P. americana maven. Nålens for stejle vinkel vil beskadige de indre organer (figur 1C), og forkert injektion fører til lækage af dsRNA-opløsningen ud af maven (figur 1D). Hvis et dsRNA lækker ud, skal dyret kasseres, og en anden injektion udføres. P. americana skal anæstesi fuldstændigt under injektionen.
Ligesom andre biologiske eksperimenter er der brug for kontrolgrupper, når RNAi-behandling udføres. Behandlingsforskellene skal bekræftes forårsaget af målrettet RNAi i stedet for på grund af dsRNA's off-target-virkninger, skaden under injektionen eller CO2 - anæstesi. Her blev Ddc (Dopa decarboxylase) og Dpp (decapentaplegic) gener udvalgt som to eksempler for at observere fænotypen af de smeltede kakerlakker efter dsRNA-injektion, og en negativ kontrol dsMock11 , som ikke har noget mål i dyrene, blev udført som en negativ kontrol, RNAi-effektiviteten blev påvist ved qRT-PCR (figur 2). Ved at tage injektionen af dsDdc som et eksempel (figur 3A, B) ville P. americana med slået ned Ddc-genet have den hvide epidermis i lang tid, da melaniseringen er blokeret (figur 3B). I forsøget med dsDpp-injektioner , som er nødvendige for regenerering af lemmer, forstyrrede RNAi regenereringen af lemmer (figur 4), som tidligere blev rapporteret9.
Figur 1: Instrument og korrekt injektionsfunktion. (A) Sprøjten på mikroinjektionsinstrumentet. (B) Korrekt placering af injektionsnålen; ingen væske kommer ud. (C) Injektionsnålens for stejle vinkel kan beskadige de indre organer. (D) Mislykket injektion resulterer i, at dsRNA-opløsningen eller hæmolymfen strømmer ud. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: RNAi-effektivitet detekteret af qRT-PCR. Knockdown-effektiviteten af Ddc- og Dpp-gener blev påvist af qRT-PCR, og dsMock blev brugt som en negativ kontrol. Der blev brugt tre replikater til hver behandling, og fejllinjerne angiver standardafvigelse for de tre replikater. Betydningen af forskelle blev analyseret af Student's t-test. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på vellykket RNAi til forstyrrelse af epidermis melanisering i P. americana. (A) Normal kakerlak efter injektion afdsMock med normal melanisering. (B) Ddc RNAi medierede albinistisk P. americana efter smeltning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempler på vellykket RNAi til forstyrrelse af lemmeregenerering i P. americana. (A) A P. americana med et amputeret bagben. (B-C) P. americana efter RNAi-behandlinger og smeltning. Bagbenet blev regenereret i dsMock-kontrolgruppe (B), men ikke når Dpp (C) genet blev tavst. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport beskrev en metodologisk trin-for-trin RNAi-strategi i P. americana; Bemærk, at det også kan anvendes på andre kakerlakker (f.eks. Blattella germanica ) og mange andre insekter med mindre ændringer. RNAi's genhæmningseffektivitet er imidlertid ikke altid høj nok, med en åbenlys ulempe sammenlignet med genknockout-strategien13. Følgende restvirkning af genniveau kan forstyrre de reelle fænotyper. For at sikre, at RNAi-behandlingen er vellykket, skal flere væsentlige betingelser overvejes, herunder dyrs fysiske tilstand, udvælgelse af kontrolgruppe, længden og koncentrationen af dsRNA-molekylerne, undgåelse af muligheden for Off-target-effekter (OTE) og vævets forskellige følsomhed over for dsRNA.
Fysisk tilstand af P. americana
Sunde dyr er forudsætningen for succesen med RNAi og forskellige genfunktionelle undersøgelser i P. americana. For at holde eksperimenter konsistente vælges kun kakerlakker, der er rejst under de samme forhold. Og kun nymfer, der er ældre end den 3. instar (ca. 19 dage efter udklækning), kan bruges, fordi yngre nymfer er for små til injektion i kropsstørrelse.
Udvælgelse af kontrolgruppe
dsMock11 og dsEGFP og den samme dosis kakerlak saltvand6 er blevet anvendt som negative kontroller. Målsekvenserne for negative kontroller bør være eksogene og ikke have nogen homologi med den endogene genetiske sekvens11. dsMock blev foretrukket, fordi brug af dsEGFP ville forsinke væksten og udviklingen af P. americana til en vis grad.
dsRNA længde
Effektiviteten af RNAi påvirkes af længden af dsRNA-molekylerne. Længere dsRNA-fragmenter er mere effektive til mRNA-hæmning, muligvis fordi det producerer flere siRNA'er, eller kortere dsRNA-fragmenter tages op af celler mindre effektivt 1. I P. americana og B. germanica synes dsRNA mellem 300 bp og 800 bp ideelt til RNAi-eksperimenter 6,9,10,14. Et kort dsRNA kan være utilstrækkeligt til at inducere et systemisk RNAi-respons, mens et langt dsRNA kan øge OTE-risikoen1.
dsRNA koncentration
Koncentrationen af dsRNA kan også påvirke effektiviteten af RNAi 1,15. For de 3. instar nymfer af P. americana synes 1 μg dsRNA at være en rimelig mængde, og 4-6 μg er egnet til voksne 6,9,14,16. Den præcise dsRNA-mængde, der anvendes til injektion, kan justeres baseret på generne, vævene og kropsstørrelsen af P. americana.
Off-target effekter
RNAi's OTE er svær at undgå i alt 17,18. To ikke-overlappende regioner af dsRNA'et kan designes til at reducere effekten af OTE på fænotyper5. Hvis dsRNA'er rettet mod to forskellige regioner har samme virkning, kan muligheden for OTE-induceret falsk positivt fænomen udelukkes.
Metode til detektion af RNAi-effektivitet
Den fænotypiske analyse er den mest intuitive tilgang til evaluering af RNAi, og qRT-PCR og Western blotting analyse er de to gyldne standarder for måling af knockdown effektivitet. qRT-PCR er en ligetil metode til bestemmelse af interferenseffektivitet på mRNA-niveau 6,9,10. Primerne skal designes ud af dsRNA-målretningsområdet. Western blotting-analysen er en anden metode til analyse af interferens på proteinniveau, men kræver specifikke antistoffer. Imidlertid observeres der undertiden ingen særlige fænotypiske virkninger, selv med høj dæmpningseffektivitet (>90%). En mulig forklaring på denne resterende effekt er massiv genfamilieudvidelse i kakerlakker; genernes redundans styrer mange særlige funktioner og fænotyper. En anden mulig forklaring er, at det mindste genekspressionsniveau, der kræves for funktionelt nok, er ekstremt lavt. Disse fører til manglende opnåelse af en bestemt fænotype, selv med høj nok RNAi-effektivitet.
Vævssekse specificitet for RNAi-følsomheden
Interferenseffektiviteten i nogle kakerlakvæv (såsom æggestokken og tilbehørskirtlerne) er ikke høj nok, hvilket kan være den gennemtrængende barriere for dsRNA 5,19; den forskellige RNAi-effekt i forskellige insektarter observeres også, hvilket afhænger af den enzymatiske nedbrydning af dsRNA i hæmolymfe15,20. Et par ideer er rimelige til forbedring af RNAi-effektiviteten i P. americana-væv, såsom fordøjelse af dsRNA i siRNA'er in vitro21, forøgelse af dsRNA-dosis og injektionstider og anvendelse af nanomaterialer som bærer til levering.
Afslutningsvis gør RNAi's høje effektivitet sammen med velkommenterede genomsekvenser9 P. americana til en god model til undersøgelse af genfunktion i en lang række udviklingsmæssige, fysiologiske og adfærdsmæssige undersøgelser. På samme måde kan denne rapport tjene som en værdifuld reference for andre insekter, der er følsomme over for dsRNA og svære at lave knockout-mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 og 31572325 til C.R., Sh.L.), af Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 og 2020A1515011267 til C.R.), af Institut for Videnskab og Teknologi i Guangdong-provinsen (Grant Nos. 2019B090905003 og 2019A0102006), af Institut for Videnskab og Teknologi i Guangzhou (Grant No. 202102020110), af Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 til Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
