Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Abstract

Het vermogen om complexe en dynamische fysiologische interacties tussen talrijke celtypen en de extracellulaire matrix (ECM) in een levende tumormicro-omgeving te visualiseren, is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van mechanismen die tumorprogressie reguleren. Hoewel dit kan worden bereikt door middel van de huidige intravitale beeldvormingstechnieken, blijft het een uitdaging vanwege de heterogene aard van weefsels en de behoefte aan ruimtelijke context binnen de experimentele observatie. Hiertoe hebben we een intravitale beeldvormingsworkflow ontwikkeld die collageen tweede harmonische generatie beeldvorming, endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) combineert als een middel om de tumormicro-omgeving niet-invasief te compartimenteren in basisdomeinen van het tumornest, het omringende stroma of ECM en de vasculatuur. Dit niet-invasieve protocol beschrijft het stapsgewijze proces, variërend van het verkrijgen van time-lapse-beelden van borsttumormodellen tot nabewerkingsanalyse en beeldsegmentatie. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat het metabole handtekeningen gebruikt om de dynamisch veranderende levende tumormicro-omgeving te contextualiseren zonder het gebruik van exogene fluorescerende labels, waardoor het voordelig is voor van de mens afgeleide xenograft (PDX) -modellen en toekomstig klinisch gebruik waar extrinsieke fluoroforen niet gemakkelijk toepasbaar zijn.

Introduction

Het is bekend dat de extracellulaire matrix (ECM) in de micro-omgeving van de tumor dynamisch wordt afgezet en geremodelleerd door meerdere celtypen om de progressie van de ziekte verder te vergemakkelijken 1,2,3. Deze matrixveranderingen bieden zowel mechanische als biologische signalen die het celgedrag veranderen en vaak resulteren in een voortdurende cyclus van matrixremodellering4. Onderzoek naar het dynamische, wederzijdse samenspel tussen tumorcellen en de extracellulaire matrix wordt vaak uitgevoerd met behulp van driedimensionale (3D) in vitro cultuur of microfluïdische systemen. Terwijl deze bottom-up benaderingen mechanismen van ECM-remodellering 5,6,7 hebben aangetoond, verhoogde proliferatie8, epitheliale naar mesenchymale overgang 9,10,11,12, en tumorcelmigratie en invasie 7,13,14,15,16 , hun focus lag voornamelijk op een paar celtypen (bijvoorbeeld tumorcellen of fibroblasten) binnen een homogene 3D-matrix in vergelijking met de diversiteit en heterogeniteit van interacties die aanwezig zijn in een fysiologisch weefsel. Naast in vitro systemen kan ook ex vivo tumorhistologie enig inzicht geven in deze cel-cel en cel-ECM interacties17. Immunohistochemie heeft het voordeel dat het meerdere celtypen kan analyseren met betrekking tot de ruimtelijk heterogene samenstelling en architectuur van de ECM, maar de statische eindpunten van vast weefsel vangen niet de dynamische aard van interacties tussen cellen en de micro-omgeving. Intravitale beeldvorming heeft de deur geopend om diverse en dynamische interacties te ondervragen binnen de fysiologische context van de inheemse tumormicro-omgeving.

De mogelijkheden van intravitale tumorbeeldvorming gaan snel vooruit. Verbeteringen in het ontwerp van beeldvormingsvensters en chirurgische technieken om de vensters te implanteren hebben longitudinale tumorbeeldvorming op lange termijn mogelijk gemaakt op verschillende anatomische locaties (d.w.z. primaire tumor, lymfeklieren, gemetastaseerde plaatsen 18,19,20). Bovendien wordt het vermogen van optische instrumentatie om gegevens in meerdere dimensies (d.w.z. spectraal, ruimtelijke fluorescentie-intensiteit en levensduur) en met hoge resolutie en snelheid (videosnelheid) te visualiseren en te verzamelen, algemeen toegankelijk. De verbeterde technologie biedt de mogelijkheid om snelle veranderingen in celsignalering en fenotypische dynamica binnen een fysiologische omgeving te onderzoeken. Ten slotte maken de uitbreiding van optogenetische hulpmiddelen en het brede scala aan genetische fluorescerende constructies het mogelijk om specifieke celtypen te taggen om celmigratie in de tumormicro-omgeving of cellijntracering tijdens ontwikkeling of ziekteprogressie vast te leggen21,22. Het gebruik van deze tools in combinatie met CRISPR/Cas9-technologie biedt onderzoekers de mogelijkheid om tijdig unieke diermodellen te genereren.

Hoewel al deze ontwikkelingen intravitale beeldvorming een steeds krachtigere methode maken om dynamische en fysiologische cellulaire interacties te verkennen, is er nog steeds een belangrijke behoefte om strategieën te ontwikkelen die ruimtelijke, temporele en structurele context op weefselniveau bieden aan deze biologische interacties. Momenteel compenseren veel intravitale beeldvormingsstudies het gebrek aan visuele oriëntatiepunten zoals bloedvaten door fluorescerende kleurstoffen in de vasculatuur te injecteren of muismodellen te gebruiken die exogene fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om fysieke kenmerken af te bakenen. Injecteerbare kleurstoffen en substraten zoals fluorescerende dextrans worden breed gebruikt om de vasculatuur met succes te labelen in intravitale collecties19, 23, 24. Deze aanpak is echter niet zonder beperkingen. Ten eerste vereist het extra muismanipulaties en is het nut ervan beperkt tot kortetermijnexperimenten. Voor longitudinale studies kan fluorescerend dextran problematisch zijn omdat we de accumulatie van dextran in fagocytische cellen of diffusie in het omliggende weefsel in de loop van de tijd waarnemen25. Exogene fluorescerende eiwitopname in het muismodel is gepresenteerd als een alternatief voor fluorescerende dextrans, maar vertoont zijn eigen beperkingen. De beschikbaarheid en diversiteit van exogene fluoroforen binnen muismodellen zijn nog steeds beperkt en duur om te maken. Bovendien zijn in specifieke modellen, zoals PDX-modellen, genetische manipulaties niet wenselijk of mogelijk. Het is ook aangetoond dat de aanwezigheid van fluorescerende of bioluminescente eiwitten in cellen worden herkend als vreemd in de muis, en binnen immunocompetente muismodellen vermindert dit de hoeveelheid metastase als gevolg van de reactie van het immuunsysteem van de gastheer26,27. Ten slotte bezetten exogene fluorescerende eiwitten of fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor ruimtelijke context of om latere gegevens te segmenteren vaak prime-bereiken van het lichtspectrum die anders zouden kunnen worden gebruikt om de fysiologische interacties van belang te onderzoeken.

Het gebruik van het intrinsieke signaal van de ECM of endogene fluorescentie van cellen in het weefsel vertegenwoordigt een potentieel universeel labelvrij middel om intravitale gegevens te segmenteren voor meer diepgaande cellulaire en ruimtelijke analyse. Second harmonic generation (SHG) wordt al lang gebruikt om de ECM28 te visualiseren. Met de daaropvolgende ontwikkeling van belangrijke hulpmiddelen om te helpen bij de karakterisering van vezelorganisatie 29,30,31, is het mogelijk om celgedrag te karakteriseren ten opzichte van de lokale ECM-structuur. Bovendien biedt autofluorescentie van de endogene metaboliet, NAD(P)H, een ander labelvrij hulpmiddel om de tumormicro-omgeving in vivo te compartimenteren. NAD(P)H fluoresceert helder in tumorcellen en kan worden gebruikt om de grenzen van het groeiende tumornest te onderscheiden van het omringende stroma21,32. Ten slotte is de vasculatuur een belangrijke fysiologische structuur in de tumormicro-omgeving en de plaats van belangrijke celtypespecifieke interacties 33,34,35. De excitatie van rode bloedcellen (RBC) of bloedplasma is gebruikt om de vasculatuur van de tumor te visualiseren, en met behulp van twee- of drie-foton excitatie (2P; 3P) is aangetoond dat het meten van bloedstroomsnelheden mogelijk is36. Hoewel grotere bloedvaten gemakkelijk te herkennen zijn aan hun endogene fluorescentiehandtekeningen, vereist de identificatie van subtiele, variabele en minder fluorescerende kleine bloedvaten meer expertise. Deze inherente moeilijkheden belemmeren een optimale beeldsegmentatie. Gelukkig kunnen deze bronnen van endogene fluorescentie (d.w.z. rode bloedcellen en bloedplasma) ook worden gemeten door fluorescentielevensbeeldvorming37, die profiteert van de unieke fotofysische eigenschappen van de vasculatuur en een nuttige aanvulling vormt op de groeiende intravitale toolbox.

In dit protocol wordt een workflow beschreven voor de segmentatie van vierdimensionale (4D) intravitale beeldvorming expliciet met behulp van intrinsieke signalen zoals endogene fluorescentie en SHG van acquisitie tot analyse. Dit protocol is met name relevant voor longitudinale studies door middel van een borstbeeldvormingsvenster waar exogene fluorescentie mogelijk niet praktisch of mogelijk is, zoals het geval is met PDX-modellen. De segmentatieprincipes die hier worden beschreven, zijn echter breed toepasbaar op intravitale gebruikers die tumorbiologie, weefselontwikkeling of zelfs normale weefselfysiologie onderzoeken. De gerapporteerde reeks analysebenaderingen stelt de gebruikers in staat om cellulair gedrag te differentiëren tussen regio's van uitgelijnde of willekeurige collageenvezelconfiguraties, aantallen of gedragingen van cellen te vergelijken die zich in specifieke regio's van de tumormicro-omgeving bevinden en de vasculatuur in kaart te brengen met behulp van alleen labelvrij of intrinsiek signaal. Samen creëren deze methoden een operationeel kader voor het maximaliseren van de diepte van informatie die wordt verkregen uit 4D intravitale beeldvorming van de borstklier, terwijl de behoefte aan extra exogene labels wordt geminimaliseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Wisconsin-Madison. Het welzijn en pijnbestrijding in alle dierproeven staat voorop. Er wordt dus alles aan gedaan om ervoor te zorgen dat het dier comfortabel en goed verzorgd is bij elke stap van de procedure.

1. Generatie van het borstbeeldvormingsvenster (MIW)

  1. Om het borstbeeldvormingsvenster te construeren, fabriceert u een ring van 14 mm van roestvrij staal van chirurgische kwaliteit.
  2. Reinig het bewerkte raamkozijn met een hete oplossing van 5% reinigingsmiddel, spoel gedurende 10 minuten onder stromend gedeïoniseerd water (DI), week 100% ethanol gedurende 10 minuten en droog vervolgens onder een warmtelamp. Autoclaaf het gedroogde MIW-frame en bewaar het voor later gebruik.
  3. Bereid MIW-afdekglas als volgt voor: Week het # 1.5 12 mm ronde dekglas gedurende 10 minuten in 100% ethanol, droog onder een warmtelamp en bevestig vervolgens aan het metalen MIW-frame met cyanoacrylaatlijm. Laat de lijm een nacht uitharden.
  4. Reinig de geassembleerde MIW van overtollige lijm met een met aceton gedrenkt wattenstaafje en reinig door het gedurende 10 minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Laat het gereinigde raam drogen. Bereid de MIW van tevoren voor en bewaar deze in een steriele petrischaal voorafgaand aan de chirurgische implantatie.

2. Chirurgische implantatie van de MIW

  1. Autoclaaf chirurgische hulpmiddelen en ontsmet oppervlakken met 70% ethanol voordat u begint met de operatie voor de raamimplantatie.
  2. Voer een operatie uit op een ontsmet tafelblad met behulp van een verwarmende deken bedekt met een steriel veld. Stel de warmhouddeken zo in dat de temperatuur gemeten bovenop het steriele veld 40 °C is.
  3. Gebruik extra koude verlichting om weefseldroging te voorkomen. Gebruik een vergrootglas om de chirurgische ingreep te vergemakkelijken. Draag PBM's bestaande uit een steriele laboratoriumjas voor eenmalig gebruik, chirurgische mouwen, handschoenen, oogbescherming en gezichtsmasker zoals aanbevolen door de chirurgische best practices.
  4. Verdoof de muis met behulp van een anesthesieverdamper met een isofluraaninstelling van 2,0% en een zuurstofstroomsnelheid van 2,0 l/min. Dien een pijnstillend middel (10 mg/kg meloxicam) toe via subcutane injectie.
    OPMERKING: Zorg voor extra doses binnen de eerste 24 uur, bij voorkeur elke 8-12 uur gedurende de eerste 2 dagen na de operatie.
  5. Eenmaal verdoofd (bevestigd door geen reactie op teenknijpen), breng dan een hydraterende ooggel aan om uitdroging van de ogen te voorkomen. Gebruik een ontharingscrème om de vacht op de operatieplaats te verwijderen (4e inguinale borstklier) gevolgd door spoelen met steriel gaas in water.
  6. Bereid de ontharende operatieplaats voor op een operatie door het huidoppervlak te ontsmetten met 3 afwisselende betadine- en ethanolscrubs.
  7. Om de operatie te beginnen, tilt u de huid voorzichtig op over de 4e borstklier nummer 4 met behulp van een tang. Zodra de huid van de lichaamswand is weggetrokken, verwijdert u een gedeelte van ~ 1 mm van de huidlaag aan de punt van de tang met een chirurgische microschaar. Als er bloeding optreedt, oefen dan zachte druk uit met steriel gaas totdat het bloeden stopt.
    OPMERKING: Over het algemeen hebben grotere tumoren een groter potentieel om te bloeden dan kleinere tumoren of normale weefsels.
  8. Maak de borstklier los van de huidlaag met zachte bewegingen van de tang bij de chirurgische opening om te voorkomen dat de onderliggende klier wordt doorgesneden.
  9. Maak een incisie van 10 mm en laat de borstklier los van de huidlaag aan de periferie, zodat hechtingen kunnen worden geplaatst zonder de borstklier te penetreren. Voeg PBS toe om de blootgestelde klier/tumor te bedekken en uitdroging te voorkomen.
  10. Maak een ringband langs de rand van de opening met behulp van 5-0 zijde gevlochten hechtdraad. Plaats een rand van de MIW zodat de dermale laag in de ontvangende inkeping van de MIW komt.
  11. Rek het epitheel aan de andere kant van de MIW voorzichtig uit en duw het metalen MIW op zijn plaats zodat de dermale laag de ontvangende inkeping volledig rond de gehele MIW-omtrek inschakelt. Maak het touwtje van de tas strak om de dermale laag in de inkeping te trekken en bind het af om de MIW volledig vast te zetten.
  12. Voeg een actueel antibioticum toe aan de huidlaag bij de MIW en controleer de muis voortdurend totdat deze voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden. Huisvest de MIW-geïmplanteerde muis afzonderlijk op zacht beddengoed met een iglo in de kooi en laat de muis 48 uur herstellen voordat hij zich afbeeldt.

3. Positionering en onderhoud van de muis op het microscooppodium voor beeldvorming

  1. Plaats de verwarmingskamer op het microscooppodium. Gebruik een geforceerd luchtsysteem dat is ingesteld op 30 °C of een ander vergelijkbaar systeem. Gebruik een objectieve verwarming om drift in z focus te voorkomen. Laat het systeem ten minste 1 uur in evenwicht komen voordat u zich afbeeldt.
    OPMERKING: Verdoofde muizen zijn niet in staat om hun lichaamstemperatuur goed te handhaven en daarom is het noodzakelijk om een verwarmde omgeving te hebben voor eventuele time-lapse-acquisities . De objectiefverwarmer helpt de effecten van thermische uitzetting te bestrijden, een fenomeen dat drift in z-focus veroorzaakt als de objectieflens en het weefsel dat in beeld wordt gebracht tot thermisch evenwicht komen.
  2. Zodra de verwarmingskamer op de microscoop is gestabiliseerd op 30 °C, verdooft u de ontvangende muis met instellingen van het anesthesieapparaat van 2% isofluraan en zuurstofstroomsnelheid van 2 l / min.
  3. Nadat de muis is verdoofd (bevestigd door geen reactie op teenknijpen), reinigt u de buitenkant van het MIW-glas met een katoenen applicator en glasreiniger, voegt u oogzalf toe om uitdroging te voorkomen en brengt u indien nodig een staartaderkatheter in.
  4. Om een goede hydratatie te behouden, geeft u een eerste injectie van 0,5 ml PBS subcutaan of 100 μL via de staartaderkatheter. Herhaal dit elke 2 uur voor de duur van de beeldvormingssessie.
  5. Zodra de muis goed is voorbereid, stelt u de microscoop in voor beeldvorming. Om de verdamping tijdens time-lapse-metingen te verminderen, gebruikt u een gel op waterbasis in plaats van water voor de dompelmedia. Dit moet worden gedaan voordat u de muis op het podium plaatst. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de optische componenten.
  6. Leg de muis op het microscooppodium, monteer de isofluraanslang en druk de kraag van de MIW in een ontvangstgat van 14 mm in de podiuminzet om de beelden te stabiliseren. Breng het beeldvormingsveld in beeld met behulp van de microscoop-oculairen en gebruik brightfield-verlichting om de vasculatuur met de bloedstroom te observeren.
  7. Controleer de stabiliteit van het gezichtsveld. Als ademhalingsbewegingsartefacten aanwezig zijn, breng dan zachte compressie aan op de achterkant van de klier met een klein schuimblok en een cinctuurachtig stuk plakband. Nadat de compressie is toegepast, controleert u of de bloedstroom in het hele gezichtsveld wordt gehandhaafd.
  8. Pas de isofluraanniveaus periodiek aan in stappen van 0,25% tijdens de beeldvormingssessie om een correct niveau van sedatie te behouden door de ademhaling van dieren handmatig te tellen.
  9. Zorg voor een snelheid van 36-40 ademhalingen per minuut (rpm) om de levensduur van dieren en optische beeldvorming te verbeteren. Lagere ademhalingssnelheden kunnen ertoe leiden dat de muis het experiment niet overleeft, terwijl ademhalingssnelheden van meer dan 60 tpm kunnen resulteren in slechte sedatie, wat de ademhaling en bewegingsartefacten in de beeldgegevens kan verhogen.

4. Instellen voor 4D, op intensiteit gebaseerde, labelvrije intravitale beeldvorming van dynamisch celgedrag

  1. Zodra de muis is verdoofd en veilig op de omgekeerde microscooptrap is geplaatst, begint u met het lokaliseren van interessante gebieden.
  2. Gebruik met behulp van een lichtbron gericht op de MIW de oculairen van de microscoop om potentiële gebieden voor onderzoek te identificeren. Voeg de x,y-posities toe en sla deze op in de software om terug te keren naar deze posities.
    OPMERKING: De fijne details van de tumor zullen niet gemakkelijk zichtbaar zijn met dit type verlichting. Het doel is simpelweg om regio's te identificeren voor verder onderzoek. De focus ligt op het zien van vasculatuur en bloedstroom.
  3. Nadat verschillende posities in de software zijn opgeslagen, bekijkt u een voorbeeld van de gekozen gezichtsvelden met behulp van 890 nm excitatie en de FAD / SHG-filterkubus. Gebruik een maximale verblijftijd van 4 μs met een lager vermogen en een hoge PMT-instelling. Het doel is om een voorbeeld van de gezichtsvelden te bekijken zonder het weefsel te overbelichten voor overmatig laserlicht.
  4. Zodra de juiste vermogensniveaus zijn ingesteld, stelt u de z-stacks in. Observeer het verschijnen van overvloedige collageenvezels (SHG) op 20-50 μm onder het glazen oppervlak van de MIW. Collageen zal minder voorkomen naarmate de microscoop dieper in de tumor snijdt (figuur 1B). Holtes in de SHG onthullen de locatie van tumormassa's.
  5. Plaats de bovenste z-slice, onder de laag solitaire cellen waar de eerste collageenvezels verschijnen op ~ 50-100 μm. Stel de onderste z-slice in op ~250 μm, waar de vezels vervagen en het slechte signaal overheerst. Herhaal dit voor alle opgeslagen x-y-posities.
  6. Zodra het z-stack-bereik is ingesteld, verhoogt u de verblijftijd (tot 8 μs) en optimaliseert u de vermogens- en detectorinstellingen. Optimaliseer de vermogensniveaus indien nodig om het weefsel voor elk experiment te prikkelen. Het gebruik van vermogens tot 90 mW bij 750 nm of 70 mW bij 890 nm bij de achterste opening van het objectief liggen binnen een acceptabel bereik.
    OPMERKING: De beelddiepte, de hoeveelheid verstrooiing in het weefsel, de objectieve kenmerken en de gevoeligheid van de detector hebben allemaal een aanzienlijke invloed op de hoeveelheid kracht die nodig is om een beeld te krijgen.
  7. Pas de tijdsintervallen aan volgens experimentele doelen. Begin met intervallen van 10 minuten tussen verzamelpunten voor de meeste intravitale migratiefilms.
  8. Hoewel 2P-excitatie zacht is voor cellen en weefsels, moet u zich bewust zijn van tekenen van fototoxiciteit, zoals celblaasjes of snel toenemende autofluorescentie en overmatig fotobleken. Verminder het laservermogen of verhoog de timelapse-intervallen als de omstandigheden dit aangeven.

5. Fluorescentie lifetime imaging (FLIM) van NAD(P)H

  1. Terwijl u de x-y-posities van de timelapse-acquisities behoudt, stelt u de microscoop in om een FLIM-stack te verzamelen. Plaats een 440/80-filter in een filterhouder voor de GaAsP-detector en stel de GaAsP-detectorspanning in de software in op 800. Doe de kamerverlichting uit wanneer de detectoren zijn ingeschakeld.
  2. Schakel in de software over van de op galvanometer gebaseerde intensiteitsbeeldvorming naar een FLIM-beeldvormingsmodus.
  3. Voor het identificeren en maskeren van de vasculatuur stelt u de resolutie in op 512 x 512 pixels. Voor het verzamelen van aanvullende metabole informatie stelt u de resolutie in op 256 x 256 pixels om de temporele resolutie van de levenslange handtekening te verhogen. Stel de verblijftijd in op 4 μs en stem de laser af op 750 nm.
  4. Begin met het scannen van een voorbeeld en begin met het aanpassen van het laservermogen. Pas het laservermogen aan totdat de uitlezing voor de constante fractiediscriminator (CFD) tussen 1 x 105 en 1 x 106 ligt. Niet groter zijn dan 1 x 106 , omdat dit zal resulteren in fotonenophoping en slechte algemene resultaten.
  5. Zodra het vermogensniveau is ingesteld, stelt u de integratietijd in tussen 90 s en 120 s en start u de FLIM-verzameling. Het zal fotonen uit het gezichtsveld verkrijgen voor de toegewezen tijd.
  6. Optioneel: Nadat alle benodigde verzamelingen zijn gemaakt en de muis van het podium is verwijderd, verzamelt u een instrumentresponsfunctie (IRF). Meet de IRF door het oppervlak van in de handel verkrijgbare ureumkristallen in een schotel met glazen bodem met dezelfde parameters in beeld te brengen en op te stellen voor het afbeelden van het weefsel.
    OPMERKING: De IRF houdt rekening met eventuele vertragingen of reflecties als gevolg van de elektronische of optische installatie. De IRF is betrokken bij alle FLIM-acquisities en het deconvolueren van de gegevens kan de nauwkeurigheid van berekende fluorescentievervalcurven verbeteren. Dat gezegd hebbende, kunnen de berekende IRF's vaak redelijkerwijs de kwaliteit van de fluorescentievervalcurven van gemeten IRF repliceren. Het is een goede gewoonte om de IRF te meten totdat is vastgesteld dat de berekende IRF equivalente aanvallen van de vervalcurven zal opleveren en de resultaten van de gemeten IRF adequaat zal benaderen.

6. Analyse van NADH Lifetime beelden

  1. Open FLIM-software en importeer de NAD(P)H lifetime image uit de dataset. Voor meer informatie over het juiste gebruik van de software, raadpleegt u de fluorescerende levensduurhandboeken (zie materiaaltabel).
  2. Definieer om te beginnen de modelparameters in de software. Klik in de menubalk op Opties > model. Schakel de volgende selectievakjes in: Instellingen > Multi-Exponentieel Verval, Fit Methode > MLE, Spatial Binning > Square, Threshold > Peak en vink Fix Shift Before Calculating Image aan.
  3. Klik in de menubalk op Kleur > A1% in het vervolgkeuzemenu. Definieer het aan de rechterkant van het venster als een driecomponenten pasvorm. Stel de bingrootte in > 3.
  4. Pas de drempelwaarde > ~10. Evalueer de drempelwaardenauwkeurigheid opnieuw nadat de vervalmatrix voor de eerste keer is berekend.
  5. Bevestig de τ1 tot 200 pk. Dit vertegenwoordigt de korte levensduur van rode bloedcellen. Probeer de waarde te vinden die het beste overeenkomt met meerdere plekken in het grotere bloedvat, wat te zien is in het intensiteitsbeeld. Bevestig de τ2 op 1200 ps. Dit vertegenwoordigt de lange levensduur van rode bloedcellen.
    OPMERKING: De ingestelde waarden zijn slechts het startpunt. De waarden zullen moeten worden geoptimaliseerd om de vasculatuur meer naar voren te brengen. In de meeste gevallen, maar niet altijd, zullen deze waarden afnemen.
  6. Selecteer onder Berekenen in de menubalk de optie Vervalmatrix. Dit genereert een eerste A1% levensduurafbeeldingen waarbij de vasculatuur hoge waarden heeft. Gebruik de cursor (vizier) om de muisaanwijzer op de vasculatuur te plaatsen. Laat systematisch en één voor één de τ1 en τ2 zweven (schakel het vakje Fix uit). Noteer deze waarden omdat ze helpen bij het optimaliseren van de vaste parameters.
    OPMERKING: Het doel is niet noodzakelijkerwijs om de meest nauwkeurige waarden in de afbeelding te krijgen, maar eerder om de ongelijkheid tussen de vasculatuur en het weefsel te maximaliseren zonder het gebied dat als vasculatuur wordt geïdentificeerd dramatisch te verminderen.
  7. Zodra de juiste parameters voor τ1 en τ2 zijn geïdentificeerd, selecteert u in de menubalk de optie Berekenen > batchverwerking. Zorg ervoor dat de meeste instellingen vergelijkbaar zijn tussen z-slices.
  8. Zorg ervoor dat u controleert of er niet één instelling is die sterk verschilt van de andere. Zo ja, pas dan eerst de shift aan en probeer het opnieuw. Als het probleem zich blijft voordoen, past u het opnieuw aan met behulp van nieuwe parameters. Een verkeerde verschuiving kan een grote oorzaak zijn van ruis in de aanvallen en kan de A1% waarden verhogen in de aangrenzende tumorgebieden.
  9. Sla op het menutabblad de bestanden op en exporteer vervolgens A1%-bestanden. Upload deze bestanden in ImageJ voor maskering en segmentatie.

7. Beeldsegmentatie van de vasculatuur

  1. Open ImageJ en importeer de A1%-afbeelding als tekstafbeelding. Herhaal dit voor alle afbeeldingen in de stapel.
  2. Terwijl alle A1%-afbeeldingen zijn geopend, selecteert u Afbeelding > Stapel > Z-Project. Gebruik de Max Intensity Projection en sla de afbeeldingen op. Zie Aanvullende gegevens 1 voor een representatieve afbeelding.
  3. Ga naar Plugins > Segmentatie. Selecteer de trainbare WEKA segmentatie plugin38.
  4. Zodra het WEKA-venster wordt geopend, gebruikt u de standaardinstellingen en begint u de software te trainen door twee klassen en overtreklijnen te maken over de vasculatuur (hoge A1% -gebieden) en niet-vasculatuur (lage A1%-gebieden).
  5. Blijf nieuwe sporen toevoegen aan de twee klassen totdat de software consequent de hoge A1% -gebieden van de vasculatuur identificeert en tegelijkertijd hogere gebieden van achtergrondgeluid elimineert. Zie Aanvullend model voor representatief classificatiemodel.
  6. Zodra de geclassificeerde afbeelding is geproduceerd, klikt u op Afbeelding > Type > 8 Bit. Drempel de afbeelding en maak een masker. Als de gedrempelde afbeelding nog verder moet worden opgeschoond, gebruikt u de functie Deeltjes analyseren .
  7. Pas de grootte en circulariteit aan totdat kleinere en cirkelvormige gebieden van de gedrempelde afbeelding zijn uitgesloten. Een schoon masker met alleen de vasculatuur en zeer weinig achtergrond wordt verkregen.
  8. Klik op > selecteren bewerken > Selectie maken. Breng de selectie over naar de ROI-manager door te klikken op > tools analyseren > ROI-manager.
  9. Dupliceer de geclassificeerde afbeelding. Ga verder naar Proces > Binair. Als u het masker wilt uitbreiden en de afstand wilt definiëren tot de vasculatuur die in de afbeeldingssegmentatie wordt opgenomen, selecteert u Verwijden. Herhaal dit totdat het masker is uitgebreid tot het gewenste bereik. Leg deze interesseregio (ROI) vast in de ROI-manager.
    OPMERKING: Het doel van deze stap is om de hoeveelheid of het gedrag binnen een bepaalde nabijheid van het bloedvat te kwantificeren (bijvoorbeeld het aantal cellen dat aanwezig is in X μm van de bloedvaten). De benodigde hoeveelheid verwijding wordt volledig bepaald door de wetenschappelijke vraag.
  10. Als u het aantal cellen binnen de beperkende gebieden wilt kwantificeren, selecteert u het gewenste venster (afbeelding/kanaal). Dit kan elk venster zijn dat hetzelfde gezichtsveld deelt als het vasculaire masker. Pas beide ROI's toe met behulp van de XOR-functie in het vervolgkeuzemenu.
    OPMERKING: Deze bewerking meet de items binnen de gewenste afstand van de vasculatuur, met uitzondering van de vasculatuur zelf. Deze gecombineerde ROI-benadering kan vervolgens worden gebruikt om een groot aantal parameters te meten, zoals intensiteit, celnummer of migratie.

8. Beeldsegmentatie van het tumornest

  1. Open de NADH-afbeelding vanuit een intensiteitsscan met hoge resolutie of een FLIM-verzameling in ImageJ.
    OPMERKING: Dit kan worden gedaan op afzonderlijke z-segmenten, volledige stapels of toegepast op z-projecties van een paar segmenten.
  2. Ga naar Plugins > Segmentation. Selecteer de trainbare WEKA-segmentatieplug-in.
  3. Zodra het WEKA-venster wordt geopend, gebruikt u de standaardinstellingen en begint u de software te trainen in twee klassen van NADH-hoge regio's en NADH-lage regio's. De NADH-hoge gebieden zullen een zeer waarneembaar patroon van cellen met kernen hebben en de software zal het gemakkelijk identificeren.
  4. Blijf heen en weer schakelen met de overlay om het algoritme te verfijnen met aanvullende training totdat het alle regio's van de tumor herkent zoals bepaald door het oog en voorkennis van tumormorfologie. Dit is een iteratief proces.
  5. Zodra het algoritme alle gebieden van de tumor herkent, selecteert u de knop Resultaat maken . Dit levert een nieuw beeld op. Dupliceer deze afbeelding.
  6. Selecteer de eerste gedupliceerde afbeelding en converteer deze naar een 8-bits afbeelding door Afbeelding > Type > 8-bits te selecteren. Drempel deze afbeelding om een binair masker te maken. Maak vervolgens een selectie en breng deze over naar de ROI-manager. Deze ROM's zullen het stroma definiëren.
  7. Selecteer de tweede van de gedupliceerde afbeelding en converteer deze naar een 8-bits afbeelding. Keer deze afbeelding om door Afbeelding > Bewerken > Omkeren te selecteren en vervolgens deze afbeelding te beperken om een binair masker te maken. Maak opnieuw een selectie en draag deze over aan de ROI-manager. Deze ROI zal het tumornest definiëren.

9. Beeldsegmentatie door vezelorganisatie of -uitlijning

  1. Open om te beginnen de SHG-afbeeldingen, bereid een z-projectie voor en beoordeel de noodzaak van eventuele voorbewerking. Voor goede resultaten zijn beelden van hoge kwaliteit met waarneembare vezels en weinig ruis vereist.
  2. Optioneel: Voor voorbewerking in ImageJ om de signaal-ruis (SNR) van het SHG-kanaal te verhogen, trekt u de achtergrond af met behulp van een rolling ball-aftrekking. Gebruik voor de meeste toepassingen een rolling ball-aftrekking tussen 20 pixels en 50 pixels. Maak vervolgens de afbeelding vloeiend en sla deze op.
  3. Open de OrientationJ-plug-in en stel de verwerkingsparameters in. Definieer in het venster OrientationJ de grootte van het lokale tensorvenster. Voor een 20x afbeelding van deze vezeldichtheid stelt u 10 pixels in op 15 pixels als uitgangspunt.
  4. Selecteer Cubic Spline als het verloopmodel en schakel het vakje Kleuronderzoek in. Definieer de kleurenenquête. Stel zowel de tint als de verzadiging in als samenhang en definieer vervolgens de helderheid als originele afbeelding, druk op Uitvoeren.
  5. Het uitvoerbestand van de plug-in is RGB colormap. Pas de waarde van het lokale tensorvenster aan totdat uitgelijnde gebieden, zoals bepaald door het oog, correct worden gemarkeerd met blauwe en magenta tinten.
  6. Zodra het uitvoerbeeld bevredigend is, scheidt u dit RGB-beeld in 3 kanalen. Selecteer Afbeelding > kleur > gesplitst kanaal.
  7. Als u de weergave van uitgelijnde gebieden wilt verbeteren met het oog op maskeren, gebruikt u de afbeeldingscalculator door Proces > afbeeldingscalculator te selecteren. Trek met deze operator de groene afbeelding af van de blauwe afbeelding. Voor een beperkend masker trekt u de groene afbeelding af van de rode afbeelding. Voor willekeurige gebieden trekt u het blauwe kanaal af van het groene kanaal.
  8. Drempel de resulterende afbeelding met behulp van het Moments-algoritme . In de meeste gevallen hoeft dit niet verder te worden aangepast. Pas echter indien nodig aan. Dit zal een binair beeld opleveren.
  9. Zodra de binaire afbeelding is gemaakt, vult u de gaten door Proces > Binaire > Vult gaten tussen vezels en rondt u de grenzen van het masker af met behulp van een mediaanfilter. Een mediaanfilter van 10 is een goed startpunt, pas het aan om goed bij de gegevens te passen. Inspecteer het masker handmatig op instemming en verwijder eventuele ROI's die onjuist zijn.
  10. Zodra het masker voldoet, maakt u een selectie door Bewerken > selectie > Selectie maken te selecteren. Breng deze selectie over naar de ROI-manager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De installatie van de MIW en de experimentele basisplanning zijn de eerste stappen in dit proces. Dit specifieke MIW-ontwerp en -protocol zijn meer vatbaar voor longitudinale studies19 en is met succes gebruikt met zowel rechtopstaande als omgekeerde microscopen. In dit geval werd een omgekeerde microscoop gebruikt omdat dit heeft geresulteerd in een grotere beeldstabiliteit van de borstklier met minder ademhalingsartefacten. In figuur 1A geven we de afmetingen van de stijve MIW en een grafisch overzicht van het implantatieproces.

Een typisch gezichtsveld binnen een labelvrije MMTV-PyMT39 borsttumor (figuur 1B-E, figuur 3A) is zeer heterogeen, bestaande uit collageenvezels, talrijke stromale cellen, massa's tumorcellen en vasculatuur (figuur 3A). Over het algemeen zijn collageenvezels overvloediger in de buurt van het venster en nemen ze in overvloed toe dieper in de tumor (figuur 1B-E) De organisatie van de vezels rond de tumormassa's kan ook behoorlijk gevarieerd zijn, vaak met regio's met een meer willekeurige organisatie in hetzelfde gezichtsveld als regio's met een hogere uitlijning (figuur 2D, H en figuur 3I).

Om een analysepijplijn te ontwikkelen die intravitale gegevens kan segmenteren in perivasculaire regio's, tumor en stroma, richtte dit protocol zich op het gebruik van het signaal van endogene NAD (P) H en SHG. Hoewel identificatie van de tumor en het stroma eenvoudig kan zijn, kan de identificatie van perivasculaire gebieden in de micro-omgeving van de tumor een uitdaging zijn. De vasculatuur bevindt zich vaak binnen de smalle linten van gereduceerd NAD(P)H signaal tussen de heldere NAD(P)H+ kankercelmassa's. Het is belangrijk op te merken dat niet alle donkere grenzen vasculatuur herbergen; integendeel, sommige donkere gebieden zijn gewoon tumorplooien of het opblazen van aangrenzende tumorlobben (gele pijl, figuur 2G). Bovendien, terwijl een doorgewinterd oog de bloedvaten met een grotere diameter uit de tumor kan halen omdat ze een onderscheidend uiterlijk hebben, is dit onderscheid niet altijd triviaal. Dit geldt vooral voor vaten met een kleinere diameter waar hun uiterlijk subtieler en variabeler kan zijn. In dit geval kan het gebruik van de fluorescentielevensduur van NAD(P)H helpen bij de positieve identificatie van de vasculatuur (figuur 2B,F). Fluorescentielevensduur (FLIM) meet niet de overvloed of intensiteit van fotonen op een locatie, maar de tijd die het kost voor die geëxciteerde moleculen om een foton uit te zenden en naar hun grondtoestand te vervallen. Van rode bloedcellen (RBC) en bloedplasma is aangetoond dat ze een karakteristieke korte en onderscheidende fluorescentielevensduurvan 32,37 hebben die kan worden gebruikt voor de identificatie en segmentatie van bloedvaten in weefsels.

Om te bepalen hoe goed de fluorescentielevensduur van NAD(P)H de vasculatuur intravitaal identificeert, werd een bolus van 100 μL van een rhodamine-gelabeld dextran in de staartader geïnjecteerd na het verzamelen van het FLIM-beeld. Vergelijkingen van maximale intensiteitsprojecties van NAD(P)H FLIM komen nauw overeen met die vaten die zijn gelabeld met een fluorescerend gelabeld dextran (figuur 2I-J). Het herhalen van deze benadering bij meerdere muizen toonde aan dat het gemiddelde maskergebied van het FLIM-beeld over het gebied van het dextran-masker 78,6% ± 12,3% was (figuur 2L). Hoewel de overlay niet 100% was, bracht deze techniek nauwkeurig het hele vasculaire netwerk in kaart. De waargenomen verschillen in de gerapporteerde gebieden kunnen vaak worden toegeschreven aan intravitale drift- of registratieproblemen, dunnere vaatdiameters als gevolg van modelaanpassing of het verlies van fijne vaten als gevolg van RBC-uitsluiting door de druk van de groeiende massa. Belangrijk is dat deze techniek even goed werkt in de aanwezigheid van zowel genetisch gecodeerde fluoroforen zoals GFP of labelvrije tumormodellen (figuur 2D, H), waardoor een zeer robuust en breed toepasbaar middel wordt geboden om de vasculatuur voor beeldsegmentatie te identificeren.

Om de grenzen van labelvrije tumormassa's af te bakenen, werd NAD(P)H autofluorescentie (figuur 1C) gebruikt. Dit kan worden vastgelegd door onafhankelijk een NAD(P)H-afbeelding te verzamelen of de NAD(P)H FLIM-gegevens op te tellen om een intensiteitsbeeld te genereren. Beide routes zorgen voor een geschikte segmentatie van de micro-omgeving van de tumor. Als algemene observatie wekt twee-foton excitatie van NAD(P)H in kankercellen heldere autofluorescentie op, waardoor een beeld ontstaat dat scherpe individuele cellen met verduisterde kernen toont (Figuur 2E,G). Dit patroon kan worden gebruikt om de omvang van de groeiende massa te definiëren. Hoewel eenvoudige op intensiteit gebaseerde drempelvorming van NAD(P)H mogelijk is om de grens van het tumorcompartiment te definiëren, presteert een trainbaar segmentatiemiddel vaak beter (figuur 3B,E). Sommige andere veel voorkomende uitlezingen, zoals celmigratie of cellulaire uitstekende analyse, kunnen baat hebben bij genetisch gecodeerde exogene fluorescentie binnen het muismodel of de implantatie van fluorescerend gelabelde cellijnen (figuur 2A). In deze gevallen kan de taak van het afbakenen van de grens van de massa worden bereikt met eenvoudige drempeling van het fluorescerende eiwit. Soms kan de expressie van de fluorofoor na implantatie behoorlijk heterogeen worden. Dit mag geen segmentatieproblemen veroorzaken. Ook is vaak waargenomen dat tumoren gemaakt door fluorescerende allografts of xenografts minder gecompartimenteerde gebieden van collageenvezels hebben dan tumoren gemaakt door genetische tumormodellen zoals MMTV-PyMT16.

Het stromale compartiment omvat de gebieden buiten de groeiende massa of tussen groeiende massa's, en een masker voor het stroma wordt verkregen door de tumor ROI om te keren (figuur 3B-F). Het stromale compartiment kan vervolgens verder worden gecompartimenteerd in sub-ROM's op basis van collageenvezelarchitectuur. Collageenvezels zijn een belangrijk kenmerk in het stroma en hebben een grote diversiteit aan vezelorganisaties, waarvan bekend is dat ze het celgedrag moduleren40,41. Vaak bestaan er talrijke lokale (<100 μm) gebieden van uitgelijnde of willekeurige vezels in het beeld16. Daarom werden gebieden met relatief uitgelijnde (rood /blauwe tinten) of willekeurige (groene tinten) vezelorganisatie (figuur 3I) geïdentificeerd met de OrientationJ-plug-in. Met behulp van de OrientationJ-kleurenkaart kunnen maskers op basis van de lokale vezelorganisatie worden gemaakt voor segmentatiedoeleinden (figuur 3J). Deze maskers kunnen vervolgens worden bedekt om differentieel dynamisch stromaal celgedrag te analyseren (figuur 3K) als gevolg van de effecten van specifieke vezelorganisatie (figuur 3H, I).

Nu ROIs voor de verschillende compartimenten van de tumormicro-omgeving zijn gedefinieerd, kunnen ze worden toegepast op de individuele frames of kanalen van de intravitale timelapse-film. Op dit punt is het belangrijk om te benadrukken dat alle signalen in figuur 3A volledig zijn afgeleid van endogene bronnen. Deze afbeelding toont het rijke potentieel van ruimtelijke en contextuele aanwijzingen die afkomstig kunnen zijn van puur endogene, alomtegenwoordige en labelvrije bronnen. Hier gebruikten we het MMTV-PyMT tumormodel als voorbeeld om de toepasbaarheid van de methode te illustreren om het aantal en de kenmerken van macrofagen binnen specifieke locaties van de tumormicro-omgeving (TME) te kwantificeren. Een eerdere intravitale studie42 heeft aangetoond dat cellen die hoge niveaus van FAD-autofluorescentie uitzenden (figuur 3A, magentacellen, gele pijlen) positief kleuren met F4/80-antilichamen en een populatie van macrofagen binnen de TME vertegenwoordigen. Met behulp van deze workflow om het beeld te segmenteren, is het mogelijk om het aantal efficiënt en nauwkeurig te onderzoeken, cel-celinteracties in de loop van de tijd te volgen of zelfs de metabole kenmerken van deze subset van macrofagen (magenta) te observeren binnen verschillende compartimenten van de TME (Figuur 3A, gele pijlen). Zo kan het gedrag van FAD-hoge macrofagen die zich specifiek binnen het NAD(P)H-hoge tumornest bevinden worden gekarakteriseerd (figuur 3E). Evenzo kan het gedrag van macrofagen met betrekking tot de lokale organisatie van de vezels in het stromagebied worden onderzocht. Sommige recente rapporten hebben aangetoond dat macrofagen en andere migrerende cellen in het stroma reageren op mechanische signalen uit hun lokale micro-omgeving 16,43,44. Met behulp van de vezeluitlijningsmaskers die door deze methode worden geproduceerd, is het mogelijk om hun differentiële gedrag tussen regio's van willekeurige en uitgelijnde collageenorganisaties te onderzoeken. Ten slotte kan dezelfde gerichte analyse ook worden toegepast om het aantal en het gedrag van macrofagen te bepalen die gelokaliseerd zijn binnen een gedefinieerde nabijheid van de vasculatuur. In figuur 3G is de vasculatuur in rood te zien en macrofagen opnieuw in magenta. Een masker voor de vasculatuur met behulp van NAD(P)H FLIM werd gemaakt en vervolgens uitgebreid door verwijding van 10 pixels. De gekozen afstand was willekeurig voor demonstratiedoeleinden, maar kan worden geoptimaliseerd voor de specifieke behoeften van het individuele experiment. Belangrijk is dat, hoewel deze afbeelding van een enkele z-slice is, deze procedure gemakkelijk kan worden geëxtrapoleerd naar 3D-stapels om gedrag rond het hele volume van het vat te observeren.

Figure 1
Figuur 1: Grafische samenvatting van borstvensterimplantatie en de onderliggende organisatie van een MMTV-PyMT-tumor. (A) De afmetingen van het borstbeeldvormingsvenster en schema voor het algemene implantatieproces. (B-E) Dit is een montage van een ongelabelde MMTV-PyMT tumorvertegenwoordiger vanaf 50 μm onder het oppervlak van de MIW en doorgaand tot een diepte van 80 μm. De dieptewaarden staan onder elke afbeelding. Collageenvezels (grijs) komen vaker voor aan het oppervlak van de tumor (NAD(P)H, blauw) dan op grotere diepten. Schaalbalk 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatief intravitaal beeld van een GFP gelabelde en labelvrije PyMT-tumor en validatie van NAD(P)H FLIM als marker voor de vasculatuur. Een samengesteld beeld (A) van een typische allograft van GFP-4T1 cellen in het borstvetkussen en een representatieve borsttumor van een MMTV-PyMT tumormodel (E). NAD(P)H FLIM brengt de vasculatuur in beide modellen in kaart (B,F). GFP-fluorescentie (C) en NAD(P)H-autofluorescentie (G) werden gebruikt om de tumor te identificeren. Collageen werd gevisualiseerd door SHG (D,H). Een samengesteld beeld met NAD(P)H FLIM om vasculatuur te identificeren werd gevalideerd door maximale intensiteitsprojecties van de intravitale stack voor en na staartaderinjectie van fluorescerend dextran (I,J,K) te vergelijken. De kwantificering van de verhouding van het gebied bepaald door NAD(P)H FLIM over het gebied geïdentificeerd door dextran injectie in vier muizen (kleur identificeert individuele muizen) en meerdere gezichtsvelden (individuele stippen in grafiek) wordt weergegeven in (L). Schaalbalken 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve beeldsegmentatie met behulp van endogene fluorescentie binnen labelvrije PyMT-tumor. Een samengesteld beeld (A) van een enkele z-slice van een typische PyMT-borsttumor werd verzameld met behulp van alleen intrinsieke signalen. SHG (grijs) visualiseert de collageenvezels van de tumor. Fluorescentielevensduurbeeldvorming van NAD(P)H-autofluorescentie (Tau (τ) gemiddelde) rapporteert de metabole signaturen van de cellen (groene tot oranje tinten) en de locatie van bloedvaten (rood). FAD-autofluorescentie (magenta) identificeert macrofagen. Met behulp van het segmentatieschema dat in dit protocol wordt beschreven, werd de labelvrije tumor gesegmenteerd in compartimenten voor het tumornest (B, E), stroma (C, F) en vasculatuur (D, G) met alleen SHG- en NAD (P) H-autofluorescentie. De stroma- en collageenvezels (H) kunnen ook worden ingedeeld in lokale regio's van uitgelijnde vezels ((weergegeven in magenta / blauw), J, K). Schaalbalken 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende gegevens 1: Representatieve dataset van gemonteerd A1% van NAD(P)H FLIM. Dit is een maximale intensiteitsprojectie van een gemonteerde A1% van een typische dataset. Het is een vertegenwoordiger van de mogelijke kwaliteit van identificatie en een typisch achtergrondniveau voordat de trainbare classifier wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend model: Representatieve classificator gebruikt op gemonteerdE A1% voor de identificatie van de vasculatuur. Dit is een voorbeeldclassificatiemodel voor gebruik in de trainbare WEKA-segmentatieplug-in binnen ImageJ. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D intravitale beeldvorming is een krachtig hulpmiddel om dynamische fysiologische interacties te onderzoeken binnen de ruimtelijke en temporele context van de inheemse tumormicro-omgeving. Dit manuscript biedt een zeer basaal en aanpasbaar operationeel kader om dynamische celinteracties binnen de tumormassa, het aangrenzende stroma of in de nabijheid van het vasculaire netwerk te compartimenteren met alleen endogene signalen van de tweede harmonische generatie of NAD (P) H-autofluorescentie. Dit protocol biedt een uitgebreide, stapsgewijze methode, van implantatie van het beeldvormingsvenster tot beeldacquisitie, analyse en segmentatie. Wij geloven dat deze techniek zal bijdragen aan een noodzakelijk analysekader om 4D intravitale gegevens te segmenteren en te kwantificeren.

Dit protocol is ontwikkeld om breed compatibel te zijn met tal van intravitale muismodellen, waaronder ongelabelde PDX-modellen. PDX's zijn een ongelooflijk informatief model45, maar vormen een uitdaging voor intravitale beeldvorming omdat de aard van het PDX-model niet goed geschikt is voor genetische manipulatie. Daarom zou het heel voordelig zijn om een methode te hebben die dynamische interacties binnen hun niet-gelabelde fysiologische omgeving kan visualiseren en compartimenteren met behulp van uitsluitend endogene metabolieten zoals NAD (P) H en tweede harmonische generatie (SHG). Naast het feit dat het voordelig is voor PDX-modellen, kan deze multidimensionale benadering theoretisch worden toegepast op elke intravitale studie in kankerachtig of normaal weefsel dat ruimtelijke en structurele context nodig heeft om een fysiologische vraag aan te pakken. NAD(P)H autofluorescentie en SHG uit collageenvezels zijn alomtegenwoordig in alle weefsels en vertegenwoordigen een universele en vrije bron in intravitale collecties. Deze FLIM-benadering is ook robuust omdat het de vasculatuur kan identificeren in de aanwezigheid van fluorescentie van exogene bronnen zoals GFP. Deze benadering is ook voordelig omdat SHG- en NAD(P)H-emissie in het blauwe spectrum kunnen worden gevisualiseerd, waardoor ze zich in een golflengte bevinden die doorgaans niet wordt gebruikt bij de beeldvorming van fluorescerende fusieconstructies die anders nodig zouden kunnen zijn voor de studie.

Het aspect van deze aanpak dat nieuw is en een bijzondere toegevoegde waarde heeft, is de labelvrije identificatie van de vasculatuur. Hoewel andere benaderingen kunnen werken, biedt het gebruik van de fluorescentielevensduur van NAD(P)H gemakkelijk een duidelijke handtekening zonder dat extra etikettering nodig is. De gegevens tonen aan dat de levenslang gedefinieerde vaten de vasculatuur weerspiegelen die is gelabeld uit staartaderinjectie van fluorescerend dextran, de gouden standaard voor vasculatuurbeeldvorming. Onze techniek blinkt uit in het visualiseren van kleinere bloedvaten in vergelijking met eenvoudige excitatie van twee fotonen of drie fotonen, waarbij grotere vaten gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd, maar kleinere meer expertise vereisen om te identificeren. De levenslange handtekening is ondubbelzinnig voor alle schepen, ongeacht de grootte. Bovendien kan deze extra NAD(P)H FLIM-acquisitie eenvoudig worden gecombineerd met andere markers voor de segmentatie van de tumormicro-omgeving. Door een enkele FLIM-acquisitie van NAD(P)H zijn de vereisten voor het definiëren van de vasculatuur, het tumornest en het stroma haalbaar. De FLIM-collectie kan worden opgenomen in het bestaande experimentele ontwerp door een enkele aankoop aan het einde of begin van een tijdreeks te verzamelen of de collecties gedurende de gehele 4D-acquisitie te verweven. De bepaling van de juiste hoeveelheid FLIM-beelden hangt af van specifieke experimentele behoeften en beperkingen, zoals acquisitie-intervallen, experimentele duur of beeldstabiliteit, maar op zijn minst is één FLIM-verzameling per 4D-serie nodig voor deze methode.

Dit proces van het gebruik van NAD(P)H FLIM voor de identificatie van de vasculatuur vereist het wiskundig aanpassen van de FLIM-gegevens aan een exponentiële functie van de vorm

Equation 1

met A1+A2+A3=1. Terwijl de meeste levenslange beelden van NAD(P)H die in de literatuur worden gerapporteerd, worden gemonteerd als een bi-exponentiële, werd NAD(P)H in deze toepassing gemonteerd als een tri-exponentiële waarbij de τ1 en τ2 zijn ingesteld op de gerapporteerde waarden van RBC's en τ3 mag zweven. Belangrijk is dat het doel niet is om de meest nauwkeurige levensduurwaarde te bereiken, maar eerder om een optimaal beeld te bieden voor segmentatie. Wanneer de τ1- en τ2-waarden in eerste instantie worden vastgesteld op de gerapporteerde waarden van RBC's32,46 en de matrix wordt berekend, zullen de bloedvaten opvallen met A1%-waarden groter dan 60% in de bloedvaten en A1%-waarden in het algemeen minder dan 40% in de aangrenzende tumor. De volgende stap is om te proberen de A1% in de bloedvaten te maximaliseren terwijl de A1% in de aangrenzende tumor wordt geminimaliseerd. Dit is een iteratief proces en aan het einde ervan zullen de A1% -waarden van de bloedvaten groter zijn dan 90% met de A1% -waarden van de tumor minder dan 10%. Zodra de A1%-waarden van de bloedvaten uniform hoog zijn en de achtergrond uniform laag, exporteert u deze A1%-bestanden naar een trainbare segmentatietool. Dit zal snel alle resterende ruis verwijderen en de ROI voor de vasculatuur definiëren.

Omdat het borstvetkussen zich buiten de lichaamsholte bevindt, is de operatie minimaal invasief en worden de beste resultaten verkregen door de MIW over de4e inguinale borstklier te implanteren. De timing van raamimplantatie en wanneer het experiment zal worden uitgevoerd, is van cruciaal belang. Het is het beste om rekening te houden met 24 - 48 uur genezing na de operatie vóór het fysiologische tijdstip dat zal worden onderzocht. Hoewel de procedure zelf slechts een kleine incisie (≈ 10 mm) vereist om het venster in te brengen (figuur 1A), zal de genezingstijd na de operatie alle ontstekingen en vloeistoffen die zich hebben opgehoopt als gevolg van het implantatieproces kunnen opruimen. Bovendien zal het ook toelaten dat de tumor in het raam blijft groeien. Beide factoren zullen de algehele beeldkwaliteit verbeteren door de dekking/verstrooiing te verminderen en de beeldstabiliteit te vergroten. Het volgende dat u moet overwegen, is de geplande totale duur van het experiment. Hoewel deze ramen zijn ontworpen voor longitudinale studies, heeft het rigide karakter van het venster een tijdslimiet van 2 tot 3 weken. Na die tijdspanne heeft het venster de neiging om los te komen van de huidlaag, waardoor het experiment wordt verontreinigd en beëindigd. Als een longitudinale studie van de borstklier niet vereist is, kunnen andere intravitale methoden zoals een terminale huidflapprocedure22 die de chirurgische implantatie van een MIW elimineert, een betere optie zijn. De huidflapprocedure biedt betere toegang tot de hele klier omdat deze niet wordt beperkt door de plaatsing en afmetingen van de MIW, en het kan een grotere beeldstabiliteit produceren als de klier wordt weggetrokken van de lichaamsholte. Ongeacht de intravitale beeldvormingsbenadering is de segmentatie van de micro-omgeving met behulp van endogene fluorescentie nog steeds breed toepasbaar voor latere beeldanalyse. Het laatste waar u rekening mee moet houden, is de duur van het individuele beeldvormingsexperiment. Het is niet onredelijk om films van 6-8 uur te kopen. Tijdens de langere collecties wordt hydratatie echter een probleem en is nauwlettende monitoring van de gezondheid van de muis vereist.

Een belangrijk voordeel van deze methode is dat de verschillende beelden van endogene fluorescentie die nodig zijn voor segmentatie van de tumormicro-omgeving relatief gemakkelijk en zonder extra manipulaties aan de muis kunnen worden verzameld. Met de hier gerapporteerde filter/dichroïsche combinatie (Table of Materials) kunnen zowel SHG- als NADH-beelden worden verkregen met dezelfde filterset door golflengten te schakelen van 890 nm naar 750 nm. Hoewel dit een acquisitievertraging veroorzaakt, heeft dit geen invloed op de daaropvolgende beeldsegmentatie. Het is ook belangrijk om te onthouden dat deze methode slechts een startpunt vormt voor een segmentatietechniek met behulp van endogene fluorescentie, en meer geavanceerde optische configuraties kunnen indien nodig gelijktijdige acquisities mogelijk maken.

Er zijn beperkingen aan het gebruik van FLIM om de vasculatuur te identificeren. De FLIM-aanpak vereist gespecialiseerde elektronica, instrumentatie en expertise om te verzamelen. Al deze vereisten worden echter steeds meer geïntegreerd in moderne microscopen en meer beschikbaar door het gebruik van beeldvormingskernfaciliteiten. FLIM is een volwassen technologie geworden en het verkrijgen van goede gegevens vereist niet veel training. Een tweede beperking is dat FLIM-overnames tijdrovend zijn. Terwijl de framesnelheid voor een afbeelding verzameld met fluorescerende dextran ongeveer een seconde of minder is, kan de gemiddelde FLIM-verzameling variëren van 60 s tot 120 s, wat onbetaalbaar kan zijn als de fysiologische tijdspunten korter zijn dan dat. FLIM-identificatie van de vasculatuur is niet bedoeld ter vervanging van alle staartader geïnjecteerde fluorescerende dextran of multifoton excitatie van de vasculatuur; integendeel, het is de zoveelste benadering in de groeiende gereedschapskist voor intravitale beeldvorming. Verder verwachten we dat de langere overnametijden de komende jaren drastisch korter zullen worden. De detectoren en elektronica verbeteren snel, waardoor de dode tijd van de detector afneemt en daardoor kortere acquisitieperioden nodig zijn om hetzelfde aantal fotonen vast te leggen. Een andere reden om optimistisch te zijn over kortere acquisitietijden is de opkomst van machine learning-software of beeldherstelalgoritme zoals CSBDeep47. Deze algoritmen kunnen mogelijk worden getraind om te werken met kortere belichtingstijden, waardoor het aantal fotonen dat nodig is om structuren voor segmentatiedoeleinden nauwkeurig te identificeren, wordt verminderd. Samen zou dit de tijdspannes die nodig zijn voor deze multidimensionale overnames snel kunnen verkorten.

Het gebruik van intravitale beeldvorming zal alleen maar belangrijker worden naarmate onderzoekers proberen de vele complexe cel-cel- en celmatrixinteracties te ontrafelen die optreden in de fysiologische tumormicro-omgeving. Daarom zijn voortdurende ontwikkelingen in de acquisitie-, segmentatie- en analysemogelijkheden nodig. Hiertoe is het belangrijk om het potentieel van endogene fluorescentie voor micromilieusegmentatie niet over het hoofd te zien. In dit protocol werd het endogene signaal van SHG en fluorescentiemetabolieten, waaronder NAD(P)H-intensiteit en FLIM, gebruikt voor segmentatiedoeleinden tijdens intravitale beeldvorming van de borst-TME. Andere endogene metabolieten of intrinsieke eigenschappen kunnen aanvullende signalen geven om de dynamische wederkerigheid van tumorcellen en de micro-omgeving te onthullen. FAD kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de beweging van immuunpopulaties42 te volgen, 3P-generatie kan structurele kenmerken zoals plasmamembranen of vet36 benadrukken en elastinefluorescentie kan worden gebruikt om slagaders van aderen te scheiden46. Daarom zal endogene fluorescentie een rijk multidimensionaal platform blijven bieden dat ten volle moet worden benut terwijl de onderzoeksgemeenschap de gereedschapskist voor intravitale micro-omgevingssegmentatie en -analyse blijft bouwen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag NCI R01 CA216248, CA206458 en CA179556 subsidies erkennen voor de financiering van dit werk. We willen ook Dr. Kevin Eliceiri en zijn beeldvormingsgroep bedanken voor hun technische expertise in de vroege ontwikkeling van ons intravitale programma. We bedanken ook Dr. Ben Cox en andere leden van de Eliceiri Fabrication Group van het Morgridge Institute for Research voor hun essentiële technische ontwerp tijdens de vroege fasen van de MIW. Dr. Ellen Dobson assisteerde bij nuttige gesprekken over de ImageJ trainbare WEKA segmentatietool. Daarnaast willen we Dr. Melissa Skala en Dr. Alexa Barres-Heaton bedanken voor het tijdige gebruik van hun microscoop. Tot slot willen we Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, bedanken voor alle doordachte discussies en adviezen over onze muisbehandeling en -verzorging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 183
Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter