Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos
Summary
Describimos un enfoque para detectar y capturar subpoblaciones celulares invasivas en tiempo real. El diseño experimental utiliza el análisis celular en tiempo real mediante el monitoreo de los cambios en la impedancia eléctrica de las células. Se pueden capturar células invasivas de cáncer, inmunes, endoteliales o estromales en tejidos complejos y se puede evaluar el impacto de los cocultivos.
Abstract
La invasión y la diseminación metastásica de las células cancerosas son la principal causa de muerte por cáncer. Los ensayos desarrollados desde el principio para medir el potencial invasivo de las poblaciones de células cancerosas generalmente generan una medición de punto final único que no distingue entre las subpoblaciones de células cancerosas con diferente potencial invasivo. Además, el microambiente tumoral consiste en diferentes células e inmunitarias y del estroma residentes que alteran y participan en el comportamiento invasivo de las células cancerosas. La invasión en los tejidos también juega un papel en las subpoblaciones de células inmunes que se defienden de los microorganismos o eliminan las células enfermas del parénquima y las células endoteliales durante la remodelación del tejido y la angiogénesis. El análisis celular en tiempo real (RTCA) que utiliza biosensores de impedancia para monitorear la invasión celular fue un gran paso adelante más allá de la medición de la invasión en el punto final: esto proporciona mediciones continuas a lo largo del tiempo y, por lo tanto, puede revelar diferencias en las tasas de invasión que se pierden en el ensayo de punto final. Utilizando la tecnología RTCA actual, ampliamos las matrices de doble cámara agregando una cámara adicional que puede contener células estromales y / o inmunes y permite medir la tasa de invasión bajo la influencia de factores secretados de células estromales o inmunes cocultivadas a lo largo del tiempo. Más allá de esto, el diseño único permite separar cámaras en cualquier momento y aislar la célula cancerosa más invasiva u otras subpoblaciones celulares que están presentes en mezclas heterogéneas de aislados tumorales probados. Estas células cancerosas más invasivas y otras subpoblaciones celulares impulsan la progresión maligna a la enfermedad metastásica, y sus características moleculares son importantes para estudios mecanicistas en profundidad, el desarrollo de sondas de diagnóstico para su detección y la evaluación de vulnerabilidades. Por lo tanto, la inclusión de medicamentos de moléculas pequeñas o grandes se puede utilizar para probar el potencial de las terapias que se dirigen al cáncer y / o subpoblaciones de células estromales con el objetivo de inhibir (por ejemplo, células cancerosas) o mejorar (por ejemplo, células inmunes) el comportamiento invasivo.
Introduction
La invasión celular es un proceso importante que permite a las células cruzar las barreras de la membrana basal en respuesta a las señales ambientales proporcionadas por las células estromales. Es un paso crucial durante varias etapas de desarrollo para las respuestas inmunes, la cicatrización de heridas, la reparación de tejidos y las neoplasias malignas que pueden progresar de lesiones locales a cánceres invasivos y metastásicos1. Los ensayos desarrollados desde el principio para medir el potencial invasivo de las poblaciones celulares generalmente generan una medición de punto final único o requieren un etiquetado previo de las células invasivas2. La integración de técnicas de microelectrónica y microfluídica se desarrolla ahora para detectar diferentes aspectos de la biología celular como la viabilidad, el movimiento y la fijación utilizando la impedancia eléctrica de células vivas en microelectrodos 3,4. La medición de la impedancia permite una evaluación cuantitativa, no invasiva y sin etiquetas del estado celular3. Aquí describimos una matriz de tres cámaras basada en el diseño del sistema de Análisis Celular en Tiempo Real (RTCA) que fue desarrollado por Abassi et al.5. La matriz de tres cámaras permite la evaluación de células cocultivadas en la invasión celular y la recuperación de células invasivas para análisis o expansión adicionales.
En el sistema analizador celular, las células invaden a través de una matriz extracelular recubierta sobre una membrana porosa y alcanzan una matriz de electrodos interdigitados colocada en el lado opuesto de la barrera. A medida que las células invasivas continúan uniéndose y ocupando esta matriz de electrodos con el tiempo, la impedancia eléctrica cambia en paralelo. El sistema actual comprende una placa de invasión y migración celular (CIM) de 16 pocillos con dos cámaras. El instrumento RTCA-DP (dual purpose) (llamado analizador de células de doble propósito en adelante) contiene sensores para la medición de impedancia y software integrado para analizar y procesar los datos de impedancia. Los valores de impedancia al inicio dependen de la fuerza iónica de los medios en los pocillos y se cambian a medida que las células se unen a los electrodos. Los cambios de impedancia dependen del número de células, su morfología y la medida en que las células se adhieren a los electrodos. Una medición de los pozos con medios antes de que se agreguen las células se considera como la señal de fondo. El fondo se resta de las mediciones de impedancia después de alcanzar el equilibrio con las celdas que se unen y se extienden sobre los electrodos. Un parámetro sin unidad del estado de las celdas en un electrodo denominado Índice de Celda (IC) se calcula de la siguiente manera: IC = (impedancia después del equilibrio – impedancia en ausencia de celdas) / valor de impedancia nominal6. Cuando se comparan las tasas de migración de diferentes líneas celulares, el Delta CI se puede utilizar para comparar el estado de la célula independientemente de la diferencia en la conexión que se representa en las primeras mediciones.
La matriz de tres cámaras de nuevo diseño se basa en el diseño existente y utiliza la cámara superior del sistema de analizador de celdas de doble propósito que contiene los electrodos. Las cámaras intermedia e inferior modificadas se adaptan para adaptar el conjunto al analizador de celdas de doble propósito para la medición y el análisis de impedancia utilizando el software integrado. Los dos principales avances que el nuevo diseño proporciona sobre la placa CIM de doble cámara existente (llamada placa analizadora celular en adelante) son: i) la capacidad de recuperarse y luego analizar las subpoblaciones celulares invasivas que están presentes en mezclas celulares heterogéneas y ii) la opción de evaluar el impacto de los factores secretados de células estromales o inmunes cocultivadas en la invasión celular (Figura 1).
Esta tecnología puede ser útil en el estudio de las subpoblaciones de células con diferentes capacidades invasivas. Eso incluye (a) células cancerosas invasivas que invaden los tejidos circundantes o vasos sanguíneos y linfáticos o extravasan en sitios de siembra metastásicos en órganos distantes, (b) células del sistema inmunitario que invaden tejidos para hacer frente a patógenos o células enfermas, (c) células endoteliales que invaden tejidos para formar nuevos vasos sanguíneos durante la reorganización de tejidos o la cicatrización de heridas, así como (d) células estromales del microambiente tumoral que soportan e invaden junto con las células cancerosas. El enfoque permite la inclusión de diafonías estromales que pueden modular la motilidad celular y la invasión. Los estudios de viabilidad que se muestran aquí utilizan esta matriz modificada centrada en la invasión de células cancerosas y la interacción con el estroma como sistema modelo, incluida la invasión endotelial en respuesta a las señales diferenciales de las células cancerosas. El enfoque se puede extrapolar para aislar células cancerosas y otros tipos de células, como subpoblaciones de células inmunes, fibroblastos o células endoteliales. Probamos líneas celulares de cáncer de mama establecidas invasivas y no invasivas como prueba de principio. También utilizamos células de invasión de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) en respuesta a células inmunes de la médula ósea humana para mostrar la viabilidad para su uso futuro también en entornos de diagnóstico clínico. Las PDX son tejidos tumorales de pacientes que se implantan en ratones modelo inmunocomprometidos o humanizados para permitir el estudio del crecimiento, la progresión y las opciones de tratamiento para el paciente original 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos modificado el diseño de una matriz de doble cámara para incluir una tercera cámara para monitorear la invasión celular en tiempo real en presencia de células estromales. Hemos observado distintos efectos de los fibroblastos cocultivados en células cancerosas invasivas y no invasivas, lo que indica que la matriz se puede utilizar para distinguir entre subpoblaciones de células cancerosas que responden de manera diferente a los factores producidos por las células estromales cocultivadas. La matriz también se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, Universidad de Utah, por proporcionarnos los xenoinjertos derivados del paciente (HCI-010). Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA205632, R21CA226542 y, en parte, por una subvención de Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
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