Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması
Summary
İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.
Abstract
Kanser hücrelerinin invazyonu ve metastatik yayılımı kanserden ölümün başlıca nedenidir. Kanser hücresi popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen testler, tipik olarak, farklı invaziv potansiyele sahip kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmayan tek bir son nokta ölçümü oluşturur. Ayrıca, tümör mikroçevresi, kanser hücrelerinin invaziv davranışını değiştiren ve bunlara katılan farklı yerleşik stromal ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Dokulara invazyon, bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının mikroorganizmaları savuşturmada veya doku yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez sırasında parankim ve endotel hücrelerinden hastalıklı hücreleri ortadan kaldırmada da rol oynar. Hücre invazyonunu izlemek için empedans biyosensörlerini kullanan Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA), invazyonun son nokta ölçümünün ötesinde ileriye doğru atılmış büyük bir adımdı: bu, zaman içinde sürekli ölçümler sağlar ve böylece son nokta analizinde kaybolan istila oranlarındaki farklılıkları ortaya çıkarabilir. Mevcut RTCA teknolojisini kullanarak, stromal ve / veya bağışıklık hücreleri içerebilen ve zaman içinde ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin etkisi altında invazyon oranını ölçmeye izin veren başka bir oda ekleyerek çift odacıklı dizileri genişlettik. Bunun ötesinde, benzersiz tasarım, odaların herhangi bir zamanda ayrılmasına ve en invaziv kanser hücresinin veya test edilen tümör izolatlarının heterojen karışımlarında bulunan diğer hücre alt popülasyonlarının izole edilmesine izin verir. Bu en invaziv kanser hücreleri ve diğer hücre alt popülasyonları, metastatik hastalığa malign ilerlemeyi tetikler ve moleküler özellikleri, derinlemesine mekanik çalışmalar, tespitleri için tanısal probların geliştirilmesi ve kırılganlıkların değerlendirilmesi için önemlidir. Bu nedenle, küçük veya büyük moleküllü ilaçların dahil edilmesi, invaziv davranışı inhibe etmek (örneğin, kanser hücreleri) veya arttırmak (örneğin, bağışıklık hücreleri) amacıyla kanser ve / veya stromal hücre alt popülasyonlarını hedef alan tedavilerin potansiyelini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Hücre invazyonu, stromal hücreler tarafından sağlanan çevresel ipuçlarına yanıt olarak hücrelerin bazal membran bariyerlerini geçmesini sağlayan önemli bir süreçtir. Lokal lezyonlardan invaziv ve metastatik kanserlere ilerleyebilen immün yanıtlar, yara iyileşmesi, doku onarımı ve maligniteler için gelişimin çeşitli aşamalarında çok önemli bir adımdır1. Hücre popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen tahliller tipik olarak tek bir son nokta ölçümü oluşturur veya invaziv hücrelerin önceden etiketlenmesini gerektirir2. Mikroelektronik ve mikroakışkan tekniklerinin entegrasyonu, mikroelektrotlar üzerindeki canlı hücrelerin elektrik empedansını kullanarak hücre biyolojisinin canlılık, hareket ve bağlanma gibi farklı yönlerini tespit etmek için geliştirilmiştir 3,4. Empedans ölçümü, hücre durumunun etiketsiz, invaziv olmayan ve kantitatif bir değerlendirmesine izin verir3. Burada, Abassi ve ark.5 tarafından geliştirilen Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA) sisteminin tasarımına dayanan üç odacıklı bir dizgeyi tanımlıyoruz. Üç odacıklı dizi, ek analizler veya genişleme için hücresel invazyon ve invaziv hücrelerin geri kazanımı üzerine ko-kültürlü hücrelerin değerlendirilmesine izin verir.
Hücre analizörü sisteminde, hücreler gözenekli bir zar üzerine kaplanmış hücre dışı bir matristen istila eder ve bariyerin karşı tarafına yerleştirilmiş interdijitasyonlu bir elektrot dizisine ulaşır. İnvaziv hücreler zamanla bu elektrot dizisini bağlamaya ve işgal etmeye devam ettikçe, elektriksel empedans paralel olarak değişir. Mevcut sistem, iki odacıklı bir hücre invazyonu ve göçü (CIM) 16 kuyucuklu plakadan oluşmaktadır. RTCA-DP (çift amaçlı) (bundan böyle çift amaçlı hücre analizörü olarak adlandırılacaktır) cihazı, empedans ölçümü için sensörler ve empedans verilerini analiz etmek ve işlemek için entegre yazılım içerir. Başlangıçtaki empedans değerleri, kuyucuklardaki ortamın iyonik gücüne bağlıdır ve hücreler elektrotlara bağlandıkça değişir. Empedans değişiklikleri, hücre sayısına, morfolojilerine ve hücrelerin elektrotlara ne ölçüde bağlandığına bağlıdır. Hücreler eklenmeden önce kuyucukların medya ile ölçülmesi, arka plan sinyali olarak kabul edilir. Arka plan, elektrotlara bağlanan ve yayılan hücrelerle dengeye ulaştıktan sonra empedans ölçümlerinden çıkarılır. Hücre İndeksi (CI) olarak adlandırılan bir elektrot üzerindeki hücrelerin durumunun birimsiz bir parametresi aşağıdaki gibi hesaplanır: CI = (dengeden sonra empedans – hücrelerin yokluğunda empedans) / nominal empedans değeri6. Farklı hücre çizgilerinin geçiş oranları karşılaştırıldığında, Delta CI, ilk birkaç ölçümde temsil edilen bağlanma farkından bağımsız olarak hücre durumunu karşılaştırmak için kullanılabilir.
Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi, mevcut tasarıma dayanır ve elektrotları içeren çift amaçlı hücre analizörü sisteminin üst odacığını kullanır. Modifiye edilmiş orta ve alt odalar, entegre yazılım kullanılarak empedans ölçümü ve analizi için montajın çift amaçlı hücre analizörüne sığdırılması için uyarlanmıştır. Yeni tasarımın mevcut çift odacıklı CIM-plakası (bundan böyle hücre analizörü plakası olarak adlandırılacaktır) üzerinde sağladığı iki önemli gelişme şunlardır: i) heterojen hücre karışımlarında bulunan invaziv hücre alt popülasyonlarını kurtarma ve daha sonra analiz etme yeteneği ve ii) ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin hücre invazyonu üzerindeki etkisini değerlendirme seçeneği (Şekil 1).
Bu teknoloji, farklı invaziv kapasitelere sahip hücrelerin alt popülasyonlarını incelemede yararlı olabilir. Bu, (a) çevre dokuları veya kan ve lenfatik damarları istila eden veya uzak organlardaki metastatik tohumlama bölgelerinde ekstravazasyon yapan invaziv kanser hücrelerini, (b) patojenleri veya hastalıklı hücreleri ele almak için dokuları istila eden bağışıklık sisteminden hücreleri, (c) doku yeniden yapılanması veya yara iyileşmesi sırasında yeni kan damarları oluşturmak için dokuları istila eden endotel hücrelerini, ayrıca (d) kanser hücrelerini destekleyen ve istila eden tümör mikro ortamından stromal hücreler. Bu yaklaşım, hücre motilitesini ve invazyonunu modüle edebilen stromal çapraz konuşmanın dahil edilmesine izin verir. Burada gösterilen fizibilite çalışmaları, kanser hücresi invazyonuna ve kanser hücrelerinden gelen diferansiyel sinyallere yanıt olarak endotel invazyonu da dahil olmak üzere stroma ile etkileşime odaklanan bu modifiye diziyi model bir sistem olarak kullanmaktadır. Yaklaşım, kanser hücrelerini ve bağışıklık hücrelerinin alt popülasyonları, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerini izole etmek için tahmin edilebilir. İnvaziv ve non-invaziv yerleşmiş meme kanseri hücre hatlarını ilkenin bir kanıtı olarak test ettik. Ayrıca, klinik tanı ortamlarında da gelecekteki kullanım için fizibilite göstermek için insan kemik iliğinden bağışıklık hücrelerine yanıt olarak hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) invazyonundan elde edilen hücreleri kullandık. PDX, orijinal hasta için büyüme, progresyon ve tedavi seçeneklerinin incelenmesine izin vermek için bağışıklık sistemi baskılanmış veya insanlaştırılmış fareler modeline implante edilen hasta tümör dokularıdır 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çift odacıklı bir dizinin tasarımını, stromal hücrelerin varlığında hücre invazyonunu gerçek zamanlı olarak izlemek için üçüncü bir oda içerecek şekilde değiştirdik. Ko-kültürlü fibroblastların invaziv ve non-invaziv kanser hücreleri üzerindeki farklı etkilerini gözlemledik, bu da dizinin ko-kültürlü stromal hücreler tarafından üretilen faktörlere farklı yanıt veren kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmak için kullanılabileceğini gösteriyor. Dizi ayrıca, de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utah Üniversitesi Huntsman Kanser Enstitüsü’nden Dr. Alana Welms’e hasta kaynaklı ksenogreftleri (HCI-010) bize sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri R01CA205632, R21CA226542 ve kısmen Agilent Technologies’den bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Ricerca sul cancro. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
