Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen
Summary
We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.
Abstract
Invasie en gemetastaseerde verspreiding van kankercellen zijn de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Assays die al vroeg zijn ontwikkeld om het invasieve potentieel van kankercelpopulaties te meten, genereren meestal een enkele eindpuntmeting die geen onderscheid maakt tussen subpopulaties van kankercellen met verschillende invasieve mogelijkheden. Ook bestaat de tumormicro-omgeving uit verschillende residente stromale en immuuncellen die veranderen en deelnemen aan het invasieve gedrag van kankercellen. Invasie in weefsels speelt ook een rol bij subpopulaties van immuuncellen die micro-organismen afweren of zieke cellen uit het parenchym en endotheelcellen elimineren tijdens weefselremodellering en angiogenese. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) die impedantiebiosensoren gebruikt om celinvasie te monitoren, was een grote stap voorwaarts dan eindpuntmeting van invasie: dit biedt continue metingen in de loop van de tijd en kan dus verschillen in invasiesnelheden onthullen die verloren gaan in de eindpunttest. Met behulp van de huidige RTCA-technologie hebben we arrays met twee kamers uitgebreid door een extra kamer toe te voegen die stromale en / of immuuncellen kan bevatten en waarmee de invasiesnelheid onder invloed van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen in de loop van de tijd kan worden gemeten. Daarnaast maakt het unieke ontwerp het mogelijk om kamers op elk moment los te maken en de meest invasieve kankercel of andere celsubpopulaties die aanwezig zijn in heterogene mixen van geteste tumorisolaten te isoleren. Deze meest invasieve kankercellen en andere celsubpopulaties stimuleren kwaadaardige progressie naar gemetastaseerde ziekte, en hun moleculaire kenmerken zijn belangrijk voor diepgaande mechanistische studies, de ontwikkeling van diagnostische sondes voor hun detectie en de beoordeling van kwetsbaarheden. De opname van geneesmiddelen met kleine of grote moleculen kan dus worden gebruikt om het potentieel te testen van therapieën die zich richten op kanker en / of subpopulaties van stromale cellen met als doel het remmen (bijv. Kankercellen) of het verbeteren (bijv. Immuuncellen) invasief gedrag.
Introduction
Celinvasie is een belangrijk proces waarmee cellen keldermembraanbarrières kunnen passeren als reactie op omgevingssignalen van stromale cellen. Het is een cruciale stap in verschillende stadia van ontwikkeling voor immuunresponsen, wondgenezing, weefselherstel en maligniteiten die kunnen evolueren van lokale laesies tot invasieve en gemetastaseerde kankers1. Assays die al vroeg zijn ontwikkeld om het invasieve potentieel van celpopulaties te meten, genereren meestal een enkele eindpuntmeting of vereisen pre-labeling van invasieve cellen2. De integratie van micro-elektronica en microfluïdica-technieken is nu ontwikkeld om verschillende aspecten van celbiologie te detecteren, zoals levensvatbaarheid, beweging en hechting met behulp van de elektrische impedantie van levende cellen op micro-elektroden 3,4. Impedantiemeting maakt een labelvrije, niet-invasieve en kwantitatieve beoordeling van de celstatusmogelijk 3. Hier beschrijven we een array met drie kamers op basis van het ontwerp van het Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systeem dat werd ontwikkeld door Abassi et al.5. De driekamerige array maakt het mogelijk om co-gekweekte cellen te beoordelen op cellulaire invasie en herstel van invasieve cellen voor aanvullende analyses of uitbreiding.
In het celanalysatorsysteem dringen cellen binnen door een extracellulaire matrix die is gecoat op een poreus membraan en bereiken een interdigitated elektrode-array aan de andere kant van de barrière. Naarmate de invasieve cellen zich in de loop van de tijd blijven hechten en deze elektrode-array bezetten, verandert de elektrische impedantie parallel. Het huidige systeem bestaat uit een celinvasie en migratie (CIM) 16-well plaat met twee kamers. Het RTCA-DP (dual purpose) (voortaan dual purpose cell analyzer genoemd) instrument bevat sensoren voor impedantiemeting en geïntegreerde software om de impedantiegegevens te analyseren en te verwerken. Impedantiewaarden bij baseline zijn afhankelijk van de ionische sterkte van media in de putten en worden veranderd als cellen zich aan de elektroden hechten. De impedantieveranderingen zijn afhankelijk van het aantal cellen, hun morfologie en de mate waarin cellen zich aan de elektroden hechten. Een meting van de putten met media voordat de cellen worden toegevoegd, wordt beschouwd als het achtergrondsignaal. De achtergrond wordt afgetrokken van impedantiemetingen na het bereiken van evenwicht met cellen die zich hechten en verspreiden op de elektroden. Een eenheidsloze parameter van de status van de cellen op een elektrode genaamd Cell Index (CI) wordt als volgt berekend: CI = (impedantie na evenwicht – impedantie bij afwezigheid van cellen) / nominale impedantiewaarde6. Wanneer migratiesnelheden van verschillende cellijnen worden vergeleken, kan de Delta CI worden gebruikt om de celstatus te vergelijken, ongeacht het verschil in hechting dat wordt weergegeven in de eerste paar metingen.
De nieuw ontworpen array met drie kamers bouwt voort op het bestaande ontwerp en maakt gebruik van de bovenste kamer van het dual purpose cell analyzer-systeem dat de elektroden bevat. De gemodificeerde midden- en onderkamers zijn aangepast om de assemblage in de dual purpose celanalysator te passen voor impedantiemeting en -analyse met behulp van de geïntegreerde software. De twee belangrijkste verbeteringen die het nieuwe ontwerp biedt ten opzichte van de bestaande CIM-plaat met twee kamers (voortaan celanalysatorplaat genoemd) zijn: i) het vermogen om invasieve celsubpopulaties die aanwezig zijn in heterogene celmengsels te herstellen en vervolgens te analyseren en ii) de optie om de impact van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen op celinvasie te beoordelen (figuur 1).
Deze technologie kan nuttig zijn bij het bestuderen van de subpopulaties van cellen met verschillende invasieve capaciteiten. Dat omvat (a) invasieve kankercellen die omliggende weefsels of bloed- en lymfevaten binnendringen of extravaseren op gemetastaseerde zaaiplaatsen in verre organen, (b) cellen van het immuunsysteem die weefsels binnendringen om ziekteverwekkers of zieke cellen aan te pakken, (c) endotheelcellen die weefsels binnendringen om nieuwe bloedvaten te vormen tijdens weefselreorganisatie of wondgenezing, evenals (d) stromale cellen uit de tumormicro-omgeving die samen met kankercellen ondersteunen en binnendringen. De aanpak maakt de opname van stromale cross-talk mogelijk die de celmotiliteit en invasie kan moduleren. De hier getoonde haalbaarheidsstudies gebruiken deze gemodificeerde array gericht op kankercelinvasie en de interactie met het stroma als een modelsysteem, inclusief endotheelinvasie als reactie op differentiële signalen van kankercellen. De aanpak kan worden geëxtrapoleerd om kankercellen en andere celtypen zoals subpopulaties van immuuncellen, fibroblasten of endotheelcellen te isoleren. We hebben invasieve en niet-invasieve gevestigde borstkankercellijnen getest als een proof of principle. We gebruikten ook cellen van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) invasie in reactie op immuuncellen uit menselijk beenmerg om haalbaarheid aan te tonen voor toekomstig gebruik, ook in klinische diagnostische omgevingen. PDX zijn tumorweefsels van patiënten die worden geïmplanteerd in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizenmodellen om studie van groei, progressie en behandelingsopties voor de oorspronkelijke patiënt mogelijk te maken 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben het ontwerp van een array met twee kamers aangepast om een derde kamer op te nemen voor het monitoren van celinvasie in realtime in aanwezigheid van stromale cellen. We hebben verschillende effecten van co-gekweekte fibroblasten op invasieve en niet-invasieve kankercellen waargenomen, wat aangeeft dat de array kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen subpopulaties van kankercellen die anders reageren op factoren die worden geproduceerd door co-gekweekte stromale cellen. De array werd ook gebruikt om d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, bedanken voor het verstrekken van de patiënt-afgeleide xenografts (HCI-010). Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01CA205632, R21CA226542 en gedeeltelijk door een subsidie van Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Ricerca sul cancro. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
