Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures
Summary
Nous décrivons une approche pour détecter et capturer des sous-populations cellulaires invasives en temps réel. La conception expérimentale utilise l’analyse cellulaire en temps réel en surveillant les changements dans l’impédance électrique des cellules. Le cancer invasif, les cellules immunitaires, endothéliales ou stromales dans les tissus complexes peuvent être capturés et l’impact des co-cultures peut être évalué.
Abstract
L’invasion et la propagation métastatique des cellules cancéreuses sont la principale cause de décès par cancer. Les tests développés très tôt pour mesurer le potentiel invasif des populations de cellules cancéreuses génèrent généralement une mesure à un seul critère d’évaluation qui ne fait pas la distinction entre les sous-populations de cellules cancéreuses ayant un potentiel invasif différent. En outre, le microenvironnement tumoral se compose de différentes cellules stromales et immunitaires résidentes qui modifient et participent au comportement invasif des cellules cancéreuses. L’invasion dans les tissus joue également un rôle dans les sous-populations de cellules immunitaires repoussant les micro-organismes ou éliminant les cellules malades du parenchyme et des cellules endothéliales pendant le remodelage des tissus et l’angiogenèse. L’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) qui utilise des biocapteurs d’impédance pour surveiller l’invasion cellulaire a été un grand pas en avant au-delà de la mesure de l’invasion par le point final : elle fournit des mesures continues au fil du temps et peut donc révéler des différences dans les taux d’invasion perdus dans le test du point final. En utilisant la technologie RTCA actuelle, nous avons élargi les réseaux à double chambre en ajoutant une chambre supplémentaire qui peut contenir des cellules stromales et / ou immunitaires et permet de mesurer le taux d’invasion sous l’influence de facteurs sécrétés par des cellules stromales ou immunitaires en co-culture au fil du temps. Au-delà de cela, la conception unique permet de détacher des chambres à tout moment et d’isoler la cellule cancéreuse la plus invasive ou d’autres sous-populations cellulaires présentes dans des mélanges hétérogènes d’isolats tumoraux testés. Ces cellules cancéreuses les plus invasives et d’autres sous-populations cellulaires entraînent une progression maligne vers une maladie métastatique, et leurs caractéristiques moléculaires sont importantes pour les études mécanistes approfondies, le développement de sondes diagnostiques pour leur détection et l’évaluation des vulnérabilités. Ainsi, l’inclusion de médicaments à petites ou grandes molécules peut être utilisée pour tester le potentiel de thérapies qui ciblent le cancer et / ou les sous-populations de cellules stromales dans le but d’inhiber (par exemple, les cellules cancéreuses) ou d’améliorer (par exemple, les cellules immunitaires) comportement invasif.
Introduction
L’invasion cellulaire est un processus important qui permet aux cellules de traverser les barrières de la membrane basale en réponse aux signaux environnementaux fournis par les cellules stromales. C’est une étape cruciale à plusieurs stades de développement pour les réponses immunitaires, la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus et les tumeurs malignes qui peuvent passer de lésions locales à des cancers invasifs et métastatiques1. Les tests développés très tôt pour mesurer le potentiel invasif des populations cellulaires génèrent généralement une mesure à un seul point final ou nécessitent un pré-marquage des cellules invasives2. L’intégration des techniques de microélectronique et de microfluidique est maintenant développée pour détecter différents aspects de la biologie cellulaire tels que la viabilité, le mouvement et l’attachement en utilisant l’impédance électrique des cellules vivantes sur les microélectrodes 3,4. La mesure de l’impédance permet une évaluation quantitative, non invasive et sans étiquette de l’état cellulaire3. Nous décrivons ici un réseau à trois chambres basé sur la conception du système d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) développé par Abassi et al.5. Le réseau à trois chambres permet d’évaluer les cellules co-cultivées sur l’invasion cellulaire et la récupération des cellules invasives pour des analyses supplémentaires ou une expansion.
Dans le système d’analyseur cellulaire, les cellules envahissent à travers une matrice extracellulaire recouverte d’une membrane poreuse et atteignent un réseau d’électrodes interdigitées positionné de l’autre côté de la barrière. Au fur et à mesure que les cellules invasives continuent de se fixer et d’occuper ce réseau d’électrodes au fil du temps, l’impédance électrique change en parallèle. Le système actuel comprend une plaque d’invasion et de migration cellulaire (CIM) de 16 puits avec deux chambres. L’instrument RTCA-DP (dual purpose) (appelé désormais analyseur de cellules à double usage) contient des capteurs pour la mesure d’impédance et un logiciel intégré pour analyser et traiter les données d’impédance. Les valeurs d’impédance au départ dépendent de la force ionique des milieux dans les puits et sont modifiées à mesure que les cellules se fixent aux électrodes. Les changements d’impédance dépendent du nombre de cellules, de leur morphologie et de la mesure dans laquelle les cellules se fixent aux électrodes. Une mesure des puits avec des milieux avant l’ajout des cellules est considérée comme le signal de fond. L’arrière-plan est soustrait des mesures d’impédance après avoir atteint l’équilibre avec des cellules se fixant et se propageant sur les électrodes. Un paramètre sans unité de l’état des cellules sur une électrode appelé indice de cellule (IC) est calculé comme suit: CI = (impédance après équilibre – impédance en l’absence de cellules) / valeur d’impédance nominale6. Lorsque les taux de migration de différentes lignées cellulaires sont comparés, l’IC Delta peut être utilisé pour comparer l’état des cellules, quelle que soit la différence d’attachement représentée dans les premières mesures.
Le nouveau réseau à trois chambres s’appuie sur la conception existante et utilise la chambre supérieure du système d’analyseur de cellules à double usage qui contient les électrodes. Les chambres intermédiaires et inférieures modifiées sont adaptées pour s’adapter à l’ensemble dans l’analyseur de cellules à double usage pour la mesure et l’analyse d’impédance à l’aide du logiciel intégré. Les deux avancées majeures que la nouvelle conception apporte par rapport à la plaque CIM à double chambre existante (appelée désormais plaque d’analyseur cellulaire) sont: i) la capacité de récupérer, puis d’analyser les sous-populations cellulaires invasives présentes dans les mélanges cellulaires hétérogènes et ii) la possibilité d’évaluer l’impact des facteurs sécrétés par les cellules stromales ou immunitaires co-cultivées sur l’invasion cellulaire (Figure 1).
Cette technologie peut être utile pour étudier les sous-populations de cellules ayant différentes capacités invasives. Cela comprend (a) les cellules cancéreuses invasives qui envahissent les tissus environnants ou les vaisseaux sanguins et lymphatiques ou extravasent sur les sites d’ensemencement métastatiques dans des organes distants, (b) les cellules du système immunitaire qui envahissent les tissus pour lutter contre les agents pathogènes ou les cellules malades, (c) les cellules endothéliales qui envahissent les tissus pour former de nouveaux vaisseaux sanguins lors de la réorganisation tissulaire ou de la cicatrisation des plaies, ainsi que (d) les cellules stromales du microenvironnement tumoral qui soutiennent et envahissent avec les cellules cancéreuses. L’approche permet l’inclusion de la diaphonie stromale qui peut moduler la motilité et l’invasion cellulaires. Les études de faisabilité présentées ici utilisent ce réseau modifié axé sur l’invasion des cellules cancéreuses et l’interaction avec le stroma comme système modèle, y compris l’invasion endothéliale en réponse aux signaux différentiels des cellules cancéreuses. L’approche peut être extrapolée pour isoler les cellules cancéreuses et d’autres types de cellules telles que les sous-populations de cellules immunitaires, les fibroblastes ou les cellules endothéliales. Nous avons testé des lignées cellulaires de cancer du sein établies invasives et non invasives comme preuve de principe. Nous avons également utilisé des cellules issues de l’invasion de xénogreffes dérivées de patients (PDX) en réponse à des cellules immunitaires de la moelle osseuse humaine afin de démontrer la faisabilité d’une utilisation future également dans des contextes de diagnostic clinique. Les PDX sont des tissus tumoraux de patients qui sont implantés dans un modèle de souris immunodéprimé ou humanisé pour permettre l’étude de la croissance, de la progression et des options de traitement pour le patient d’origine 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons modifié la conception d’un réseau à double chambre pour inclure une troisième chambre pour surveiller l’invasion cellulaire en temps réel en présence de cellules stromales. Nous avons observé des effets distincts des fibroblastes co-cultivés sur les cellules cancéreuses invasives et non invasives, ce qui indique que le réseau peut être utilisé pour distinguer les sous-populations de cellules cancéreuses qui répondent différemment aux facteurs produits par les cellules stromales co-cultivées…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la Dre Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, Université de l’Utah, de nous avoir fourni les xénogreffes dérivées du patient (HCI-010). Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01CA205632, R21CA226542, et en partie, par une subvention d’Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
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