זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות
Summary
אנו מתארים גישה לאיתור ולכידת תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים בזמן אמת. התכנון הניסויי משתמש באנליזה תאית בזמן אמת על ידי ניטור שינויים בעכבה החשמלית של תאים. סרטן פולשני, תאי חיסון, אנדותל או סטרומל ברקמות מורכבות יכולים להיתפס, וניתן להעריך את ההשפעה של תרביות משותפות.
Abstract
פלישה והתפשטות גרורתית של תאים סרטניים הם הגורם העיקרי למוות מסרטן. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים סרטניים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת שאינה מבחינה בין תת-אוכלוסיות של תאים סרטניים עם פוטנציאל פולשני שונה. כמו כן, המיקרו-סביבה של הגידול מורכבת מתאים סטרומליים וחיסון שונים, המשנים את ההתנהגות הפולשנית של תאים סרטניים ומשתתפים בהם. פלישה לרקמות ממלאת גם תפקיד בתת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון הנלחמות במיקרואורגניזמים או בסילוק תאים חולים מתאי הפרנכימה והאנדותל במהלך שיפוץ רקמות ואנגיוגנזה. אנליזה תאית בזמן אמת (RTCA) המשתמשת בביו-סנסורים של עכבה כדי לנטר את פלישת התאים הייתה צעד גדול קדימה מעבר למדידת נקודת הקצה של הפלישה: זו מספקת מדידות רציפות לאורך זמן ובכך יכולה לחשוף הבדלים בשיעורי הפלישה שאבדו במבחן נקודות הקצה. באמצעות טכנולוגיית RTCA הנוכחית, הרחבנו מערכים דו-תאיים על ידי הוספת תא נוסף שיכול להכיל תאים סטרומליים ו/או חיסוניים ומאפשר למדוד את קצב הפלישה בהשפעת גורמים מופרשים מתאי סטרומל או מערכת החיסון בתרבית משותפת לאורך זמן. מעבר לכך, העיצוב הייחודי מאפשר ניתוק תאים בכל עת ובידוד של התא הסרטני הפולשני ביותר, או תת-אוכלוסיות תאים אחרות הנמצאות בתערובות הטרוגניות של מבודדי גידול שנבדקו. תאים סרטניים פולשניים אלה ותת-אוכלוסיות תאים אחרות מניעים התקדמות ממאירה למחלות גרורתיות, ומאפייניהן המולקולריים חשובים למחקרים מכניסטיים מעמיקים, לפיתוח בדיקות אבחון לגילוין ולהערכת פגיעויות. לפיכך, ניתן להשתמש בהכללה של תרופות בעלות מולקולות קטנות או גדולות כדי לבחון את הפוטנציאל של טיפולים המכוונים לסרטן ו/או לתת-אוכלוסיות של תאים סטרומליים במטרה לעכב (למשל, תאים סרטניים) או לשפר (למשל, תאי מערכת החיסון) התנהגות פולשנית.
Introduction
פלישת תאים היא תהליך חשוב המאפשר לתאים לחצות מחסומים של קרום מרתף בתגובה לרמזים סביבתיים המסופקים על ידי תאים סטרומליים. זהו שלב מכריע במהלך מספר שלבים של התפתחות לתגובות חיסוניות, ריפוי פצעים, תיקון רקמות וממאירויות שיכולות להתקדם מנגעים מקומיים לסרטן פולשני וגרורות1. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת או דורשים תיוג מראש של תאים פולשים2. השילוב של מיקרו-אלקטרוניקה וטכניקות של מיקרופלואידיקה פותח כעת כדי לזהות היבטים שונים של הביולוגיה של התא, כגון כדאיות, תנועה והתקשרות באמצעות העכבה החשמלית של תאים חיים על מיקרו-אלקטרוניקה 3,4. מדידת עכבה מאפשרת הערכה נטולת תוויות, לא פולשנית וכמותית של מצב התא3. כאן אנו מתארים מערך בעל שלושה תאים המבוסס על תכנון מערכת האנליזה התאית בזמן אמת (RTCA) שפותחה על ידי Abassi et al.5. המערך בעל שלושת התאים מאפשר הערכה של תאים בתרבית משותפת על פלישה תאית והתאוששות של תאים פולשים לצורך ניתוחים או התפשטות נוספים.
במערכת מנתחי התאים, תאים פולשים דרך מטריצה חוץ-תאית המצופה על ממברנה נקבובית ומגיעים למערך אלקטרודות משולב הממוקם בצד הנגדי של המחסום. כאשר התאים הפולשים ממשיכים להתחבר ולתפוס את מערך האלקטרודות הזה לאורך זמן, העכבה החשמלית משתנה במקביל. המערכת הנוכחית כוללת צלחת 16 בארות פלישה והגירה של תאים (CIM) עם שני תאים. מכשיר RTCA-DP (דו-תכליתי) (הנקרא מנתח תאים דו-תכליתי) מכיל חיישנים למדידת עכבה ותוכנה משולבת לניתוח ועיבוד נתוני העכבה. ערכי העכבה בנקודת ההתחלה תלויים בחוזק היוני של המדיה בבארות ומשתנים כאשר התאים נצמדים לאלקטרודות. שינויי העכבה תלויים במספר התאים, במורפולוגיה שלהם ובמידה שבה התאים מתחברים לאלקטרודות. מדידה של הבארות עם המדיה לפני הוספת התאים נחשבת לאות הרקע. הרקע מופחת ממדידות עכבה לאחר שהגיע לשיווי משקל כאשר תאים מתחברים ומתפשטים על האלקטרודות. פרמטר ללא יחידה של מצב התאים על אלקטרודה המכונה אינדקס תאים (CI) מחושב כדלקמן: CI = (עכבה לאחר שיווי משקל – עכבה בהיעדר תאים) / ערך עכבהנומינלית 6. כאשר משווים את שיעורי ההעברה של קווי תאים שונים, ניתן להשתמש ב- Delta CI כדי להשוות את מצב התא ללא קשר להבדל בהיצמדות המיוצג במדידות הראשונות.
המערך התלת-תאי החדש שתוכנן מתבסס על העיצוב הקיים ומשתמש בתא העליון ממערכת מנתח התאים הדו-תכליתית המכילה את האלקטרודות. התאים האמצעיים והתחתונים שהשתנו מותאמים כדי להתאים את ההרכבה למנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה וניתוח באמצעות התוכנה המשולבת. שתי ההתפתחויות העיקריות שהתכנון החדש מספק על פני לוחית ה-CIM הדו-תאית הקיימת (הנקראת מעתה צלחת מנתחת תאים) הן: 1) היכולת להתאושש, ולאחר מכן לנתח תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים הנמצאים בתערובות תאים הטרוגניות, ו-ב) האפשרות להעריך את ההשפעה של גורמים מופרשים מתאים סטרומליים או חיסוניים בתרבית משותפת על פלישת תאים (איור 1).
טכנולוגיה זו יכולה להיות שימושית בחקר תת-האוכלוסיות של תאים בעלי יכולות פולשניות שונות. זה כולל (א) תאים סרטניים פולשים הפולשים לרקמות הסובבות או לדם ולכלי הלימפה או מתרבים באתרי זריעה גרורתיים באיברים מרוחקים, (ב) תאים ממערכת החיסון הפולשים לרקמות כדי להתמודד עם פתוגנים או תאים חולים, (ג) תאי אנדותל הפולשים לרקמות ויוצרים כלי דם חדשים במהלך ארגון מחדש של רקמות או ריפוי פצעים, כמו גם (ד) תאים סטרומליים מהמיקרו-סביבה של הגידול התומכים ופולשים יחד עם תאים סרטניים. הגישה מאפשרת הכללה של דיבורים צולבים סטרומליים שיכולים לווסת את תנועתיות התא ואת הפלישה. מחקרי ההיתכנות המוצגים כאן משתמשים במערך שונה זה המתמקד בפלישה לתאים סרטניים ובאינטראקציה עם הסטרומה כמערכת מודל, כולל פלישת אנדותל בתגובה לאותות דיפרנציאליים מתאי הסרטן. ניתן לבצע אקסטרפולציה של הגישה כדי לבודד תאים סרטניים וסוגי תאים אחרים כגון תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים או תאי אנדותל. בדקנו קווי תאי סרטן שד פולשניים ולא פולשניים מבוססים כהוכחה עקרונית. השתמשנו גם בתאים מפלישה של קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה בתגובה לתאי מערכת החיסון ממח העצם האנושי כדי להראות היתכנות לשימוש עתידי גם במסגרות אבחון קליניות. PDX הן רקמות גידול של מטופלים המושתלות במודל עכברים מדוכאי חיסון או הומניזציה כדי לאפשר לימוד של אפשרויות גדילה, התקדמות וטיפול בחולה המקורי 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינינו את העיצוב של מערך דו-תאי כך שיכלול תא שלישי לניטור פלישת תאים בזמן אמת בנוכחות תאים סטרומליים. ראינו השפעות ברורות של פיברובלסטים בתרבית משותפת על תאים סרטניים פולשניים ולא פולשניים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש במערך כדי להבחין בין תת-אוכלוסיות של תאים סרטניים המגיבים באופן שונה ל…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר אלנה וולמס, מכון האנטסמן לסרטן, אוניברסיטת יוטה, על שסיפקה לנו את הקסנוגרפטים שמקורם בחולה (HCI-010). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01CA205632, R21CA226542, ובחלקה, על ידי מענק מאג’ילנט טכנולוגיות.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Ricerca sul cancro. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
