वास्तविक समय का पता लगाने और सह संस्कृतियों से इनवेसिव सेल Subpopulations के कैप्चर
Summary
हम वास्तविक समय में आक्रामक सेल उप-आबादी का पता लगाने और कैप्चर करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन कोशिकाओं के विद्युत प्रतिबाधा में परिवर्तन की निगरानी करके वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण का उपयोग करता है। जटिल ऊतकों में आक्रामक कैंसर, प्रतिरक्षा, एंडोथेलियल या स्ट्रोमल कोशिकाओं पर कब्जा किया जा सकता है, और सह-संस्कृतियों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है।
Abstract
कैंसर कोशिकाओं का आक्रमण और मेटास्टैटिक प्रसार कैंसर से मृत्यु का प्रमुख कारण है। कैंसर सेल आबादी की आक्रामक क्षमता को मापने के लिए जल्दी विकसित Assays आमतौर पर एक एकल समापन बिंदु माप उत्पन्न करते हैं जो विभिन्न आक्रामक क्षमता के साथ कैंसर सेल उप-आबादी के बीच अंतर नहीं करता है। इसके अलावा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न निवासी स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं जो कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार को बदलते हैं और भाग लेते हैं। ऊतकों में आक्रमण भी प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी में एक भूमिका निभाता है जो सूक्ष्मजीवों को बंद कर देता है या ऊतक रीमॉडलिंग और एंजियोजेनेसिस के दौरान पैरेन्काइमा और एंडोथेलियल कोशिकाओं से रोगग्रस्त कोशिकाओं को समाप्त करता है। रियल-टाइम सेलुलर विश्लेषण (RTCA) जो सेल आक्रमण की निगरानी करने के लिए प्रतिबाधा बायोसेंसर का उपयोग करता है, आक्रमण के समापन बिंदु माप से परे एक प्रमुख कदम था: यह समय के साथ निरंतर माप प्रदान करता है और इस प्रकार आक्रमण दरों में अंतर प्रकट कर सकता है जो समापन बिंदु परख में खो गए हैं। वर्तमान आरटीसीए तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने एक और कक्ष जोड़कर दोहरे-कक्ष सरणियों का विस्तार किया जिसमें स्ट्रोमल और / या प्रतिरक्षा कोशिकाएं हो सकती हैं और समय के साथ सह-सुसंस्कृत स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्रावित कारकों के प्रभाव में आक्रमण की दर को मापने की अनुमति देता है। इसके अलावा, अद्वितीय डिजाइन किसी भी समय कक्षों को अलग करने और सबसे आक्रामक कैंसर सेल, या अन्य सेल उप-आबादी को अलग करने की अनुमति देता है जो परीक्षण किए गए ट्यूमर आइसोलेट्स के विषम मिश्रणों में मौजूद हैं। ये सबसे आक्रामक कैंसर कोशिकाएं और अन्य सेल उप-आबादी मेटास्टैटिक रोग के लिए घातक प्रगति को प्रेरित करती हैं, और उनकी आणविक विशेषताएं गहराई से यांत्रिक अध्ययन, उनका पता लगाने के लिए नैदानिक जांच के विकास और कमजोरियों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, छोटे या बड़े अणु दवाओं को शामिल करने का उपयोग उपचारों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो कैंसर और / या स्ट्रोमल सेल उप-आबादी को बाधित करने (जैसे, कैंसर कोशिकाओं) या बढ़ाने (जैसे, प्रतिरक्षा कोशिकाओं) आक्रामक व्यवहार के लक्ष्य के साथ लक्षित करते हैं।
Introduction
सेल आक्रमण एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो कोशिकाओं को स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा प्रदान किए गए पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में तहखाने झिल्ली बाधाओं को पार करने की अनुमति देती है। यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, घाव भरने, ऊतक की मरम्मत, और दुर्दमताओं के लिए विकास के कई चरणों के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है जो स्थानीय घावों से आक्रामक और मेटास्टैटिक कैंसरतक प्रगति कर सकते हैं। सेल आबादी की आक्रामक क्षमता को मापने के लिए जल्दी विकसित Assays आमतौर पर एक एकल समापन बिंदु माप उत्पन्न करते हैं या आक्रामक कोशिकाओं के पूर्व-लेबलिंग की आवश्यकता होतीहै 2। माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक्स और माइक्रोफ्लुइडिक्स तकनीकों का एकीकरण अब सेल जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है जैसे कि व्यवहार्यता, आंदोलन, और लगाव माइक्रोइलेक्ट्रोड्स 3,4 पर जीवित कोशिकाओं की विद्युत प्रतिबाधा का उपयोग करके। प्रतिबाधा माप एक लेबल मुक्त, गैर-आक्रामक और सेल स्थिति 3 के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देताहै। यहां हम रियल-टाइम सेलुलर एनालिसिस (आरटीसीए) सिस्टम के डिजाइन के आधार पर एक तीन-कक्षीय सरणी का वर्णन करते हैं जिसे अबासी एट अल.5 द्वारा विकसित किया गया था। तीन-कक्षीय सरणी सेलुलर आक्रमण पर सह-सुसंस्कृत कोशिकाओं के मूल्यांकन और अतिरिक्त विश्लेषण या विस्तार के लिए आक्रामक कोशिकाओं की वसूली की अनुमति देती है।
सेल विश्लेषक प्रणाली में, कोशिकाएं एक झरझरा झिल्ली पर लेपित एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण करती हैं और बाधा के विपरीत तरफ स्थित एक इंटरडिजिटेड इलेक्ट्रोड सरणी तक पहुंचती हैं। जैसा कि इनवेसिव कोशिकाएं समय के साथ इस इलेक्ट्रोड सरणी को संलग्न और कब्जा करना जारी रखती हैं, विद्युत प्रतिबाधा समानांतर में बदल जाती है। वर्तमान प्रणाली में दो कक्षों के साथ एक सेल आक्रमण और माइग्रेशन (सीआईएम) 16-अच्छी तरह से प्लेट शामिल है। RTCA-DP (दोहरे उद्देश्य) (जिसे आगे से दोहरी उद्देश्य सेल विश्लेषक कहा जाता है) उपकरण में प्रतिबाधा माप के लिए सेंसर होते हैं और प्रतिबाधा डेटा का विश्लेषण और संसाधित करने के लिए एकीकृत सॉफ़्टवेयर होते हैं। बेसलाइन पर प्रतिबाधा मान कुओं में मीडिया की आयनिक ताकत पर निर्भर करते हैं और कोशिकाओं को इलेक्ट्रोड से संलग्न करने के रूप में बदल दिया जाता है। प्रतिबाधा परिवर्तन कोशिकाओं की संख्या, उनकी आकृति विज्ञान, और इलेक्ट्रोड से जुड़ी कोशिकाओं की सीमा पर निर्भर करते हैं। कोशिकाओं को जोड़ने से पहले मीडिया के साथ कुओं का एक माप पृष्ठभूमि संकेत के रूप में माना जाता है। इलेक्ट्रोड पर संलग्न और फैलने वाली कोशिकाओं के साथ संतुलन तक पहुंचने के बाद पृष्ठभूमि को प्रतिबाधा माप से घटाया जाता है। एक इलेक्ट्रोड पर कोशिकाओं की स्थिति का एक इकाईहीन पैरामीटर जिसे सेल इंडेक्स (सीआई) कहा जाता है, की गणना निम्नानुसार की जाती है: CI = (संतुलन के बाद प्रतिबाधा – कोशिकाओं की अनुपस्थिति में प्रतिबाधा) / नाममात्र प्रतिबाधा मान6। जब विभिन्न सेल लाइनों की माइग्रेशन दरों की तुलना की जाती है, तो डेल्टा सीआई का उपयोग पहले कुछ मापों में दर्शाए गए अनुलग्नक में अंतर की परवाह किए बिना सेल स्थिति की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
नए डिजाइन किए गए तीन-कक्षीय सरणी मौजूदा डिजाइन पर बनाता है और दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक प्रणाली से शीर्ष कक्ष का उपयोग करता है जिसमें इलेक्ट्रोड होते हैं। संशोधित मध्य और नीचे के कक्षों को एकीकृत सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रतिबाधा माप और विश्लेषण के लिए दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक में असेंबली को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। दो प्रमुख प्रगति जो नया डिज़ाइन मौजूदा दोहरे-कक्ष सीआईएम-प्लेट (जिसे सेल विश्लेषक प्लेट कहा जाता है) पर प्रदान करता है, वे हैं: i) पुनर्प्राप्त करने की क्षमता, और फिर आक्रामक सेल उप-आबादी का विश्लेषण करें जो विषम सेल मिश्रणों में मौजूद हैं और ii) सेल आक्रमण पर सह-सुसंस्कृत स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्रावित कारकों के प्रभाव का आकलन करने का विकल्प (चित्रा 1)।
यह तकनीक विभिन्न आक्रामक क्षमताओं के साथ कोशिकाओं की उप-आबादी का अध्ययन करने में उपयोगी हो सकती है। इसमें (ए) आक्रामक कैंसर कोशिकाएं शामिल हैं जो आसपास के ऊतकों या रक्त और लसीका वाहिकाओं पर आक्रमण करती हैं या दूर के अंगों में मेटास्टैटिक सीडिंग साइटों पर अतिरिक्त होती हैं, (बी) प्रतिरक्षा प्रणाली से कोशिकाएं जो रोगजनकों या रोगग्रस्त कोशिकाओं से निपटने के लिए ऊतकों पर आक्रमण करती हैं, (सी) एंडोथेलियल कोशिकाएं जो ऊतक पुनर्गठन या घाव भरने के दौरान नई रक्त वाहिकाओं को बनाने के लिए ऊतकों पर आक्रमण करती हैं, साथ ही (डी) ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से स्ट्रोमल कोशिकाएं जो कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ समर्थन और आक्रमण करती हैं। दृष्टिकोण स्ट्रोमल क्रॉस-टॉक को शामिल करने की अनुमति देता है जो सेल गतिशीलता और आक्रमण को संशोधित कर सकता है। यहां दिखाए गए व्यवहार्यता अध्ययन कैंसर सेल आक्रमण और एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्ट्रोमा के साथ बातचीत पर केंद्रित इस संशोधित सरणी का उपयोग करते हैं, जिसमें कैंसर कोशिकाओं से अंतर संकेतों के जवाब में एंडोथेलियल आक्रमण शामिल है। कैंसर कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकारों जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, या एंडोथेलियल कोशिकाओं की उप-आबादी को अलग करने के लिए दृष्टिकोण को एक्सट्रपलेटेड किया जा सकता है। हमने सिद्धांत के प्रमाण के रूप में आक्रामक और गैर-आक्रामक स्थापित स्तन कैंसर सेल लाइनों का परीक्षण किया। हमने नैदानिक नैदानिक सेटिंग्स में भविष्य के उपयोग के लिए व्यवहार्यता दिखाने के लिए मानव अस्थि मज्जा से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जवाब में रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) आक्रमण से कोशिकाओं का भी उपयोग किया। पीडीएक्स रोगी ट्यूमर ऊतक हैं जो मूल रोगी 7,8 के लिए विकास, प्रगति और उपचार विकल्पों के अध्ययन की अनुमति देने के लिए इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड या मानवीकृत चूहों के मॉडल में प्रत्यारोपित किए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने स्ट्रोमल कोशिकाओं की उपस्थिति में वास्तविक समय में सेल आक्रमण की निगरानी के लिए एक तीसरे कक्ष को शामिल करने के लिए एक दोहरे-कक्ष वाले सरणी के डिजाइन को संशोधित किया है। हमने आक्रामक और गैर-आक्राम?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ अलाना वेल्म्स, हंट्समैन कैंसर इंस्टीट्यूट, यूटा विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहते हैं, जो हमें रोगी-व्युत्पन्न (एचसीआई -010) प्रदान करने के लिए है। इस काम को एनआईएच अनुदान R01CA205632, R21CA226542, और भाग में, Agilent Technologies से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
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