Summary
Denne protokol beskriver en konfokal billeddannelsesteknik til påvisning af tre fusionstilstande i bovin adrenal kromaffinceller. Disse fusionstilstande omfatter 1) tæt fusion (også kaldet kiss-and-run), der involverer fusionsporeåbning og lukning, 2) opholdsfusion, der involverer fusionsporeåbning og vedligeholdelse af den åbne pore, og 3) krympefusion, der involverer smeltet vesikelkrympning.
Abstract
Dynamisk fusion pore åbning og lukning medierer exocytose og endocytose og bestemmer deres kinetik. Her demonstreres det i detaljer, hvordan konfokal mikroskopi blev brugt i kombination med patch-clamp-optagelse til at detektere tre fusionstilstande i primære dyrkningskrumbarkhormonceller. De tre fusionstilstande omfatter 1) tæt fusion (også kaldet kiss-and-run), der involverer fusionsporeåbning og lukning, 2) opholdsfusion, der involverer fusionsporeåbning og vedligeholdelse af den åbne pore, og 3) krympefusion, der involverer krympning af den fusionsgenererede Ω-formprofil, indtil den smelter helt sammen ved plasmamembranen.
For at detektere disse fusionstilstande blev plasmamembranen mærket ved overekspression af mNeonGreen fastgjort med PH-domænet for phospholipase C δ (PH-mNG), som binder til phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns (4,5) P2) ved plasmamembranens cytosolvendte folder; vesikler blev fyldt med den fluorescerende falske neurotransmitter FFN511 for at detektere frigivelse af vesikulært indhold; og Atto 655 blev inkluderet i badeopløsningen for at detektere fusionsporelukning. Disse tre fluorescerende sonder blev afbildet samtidigt ved ~ 20-90 ms pr. Ramme i levende kromaffinceller for at detektere fusionsporeåbning, indholdsfrigivelse, fusionsporelukning og fusion af vesikelstørrelsesændringer. Analysemetoden er beskrevet for at skelne mellem tre fusionstilstande og disse fluorescensmålinger. Metoden beskrevet her kan i princippet gælde for mange sekretoriske celler ud over kromaffinceller.
Introduction
Membranfusion formidler mange biologiske funktioner, herunder synaptisk transmission, blodsukkerhomeostase, immunrespons og viral indgang 1,2,3. Exocytose, der involverer vesikelfusion ved plasmamembranen, frigiver neurotransmittere og hormoner for at opnå mange vigtige funktioner, såsom neuronale netværksaktiviteter. Fusion åbner en pore for at frigive vesikulært indhold, hvorefter poren kan lukke for at hente fusionsvesikel, som kaldes kiss-and-run 1,4. Både irreversibel og reversibel fusionsporeåbning kan måles med celletilsluttede kapacitansoptagelser kombineret med fusionsporekonduktansoptagelser af enkelt vesikelfusion.
Dette fortolkes ofte som udtryk for fuldkollapsfusion, der involverer udvidelse af fusionen indtil udfladning af smelteversilen, og kys-og-løb, der involverer fusionsporeåbning og lukning, henholdsvis 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nylige konfokale og stimulerede emissionsudtømning (STED) billeddannelsesundersøgelser i kromaffinceller observerede direkte fusionsporeåbning og lukning (kiss-and-run, også kaldet tæt fusion), fusionsporeåbning, der opretholder en Ω form med en åben pore i lang tid, betegnet opholdsfusion og krympning af fusionsveklen, indtil den er fuldstændig fusioneret med plasmamembranen, som erstatter fuldkollapsfusionsfusion til fusion af vesikler med plasmamembranen4, 8,14,15,16,17.
I neuroner er fusionsporeåbning og -lukning blevet detekteret med billeddannelse, der viser frigivelsen af kvanteprikker forudindlæst i vesikler, der er større end fusionsporen, og med fusionsporekonduktansmålinger ved frigivelsesfladen af nerveterminaler 5,18,19. Adrenal kromaffinceller anvendes i vid udstrækning som en model til undersøgelse af exo- og endocytose20,21. Selvom kromaffinceller indeholder store tætte kernevesikler, mens synapser indeholder små synaptiske vesikler, er exocytose- og endocytoseproteinerne i kromaffinceller og synapser ret analoge 10,11,12,20,21,22,23.
Her beskrives en metode til måling af disse tre fusionstilstande ved hjælp af en konfokal billeddannelsesmetode kombineret med elektrofysiologi i bovin adrenalkromaffinceller (figur 1). Denne metode involverer indlæsning af fluorescerende falske neurotransmittere (FFN511) i vesikler for at detektere exocytose; tilsætning af Atto 655 (A655) i badeopløsningen for at fylde den fusionsgenererede Ω-formprofil og mærkning af plasmamembranen med PH-domænet for phospholipase C δ (PH), som binder til PtdIns (4,5) P2 ved plasmamembranen 8,15,24. Fusionsporedynamik kan detekteres gennem ændringer i forskellige fluorescerende intensiteter. Selvom det er beskrevet for chromaffinceller, kan princippet om denne metode, der er beskrevet her, anvendes bredt på mange sekretoriske celler langt ud over kromaffinceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Dyrebrugsproceduren fulgte NIH-retningslinjerne og blev godkendt af NIH Animal Care and Use Committee.
1. Bovin kromaffincellekultur
- Forbered Lockes opløsning (tabel 1) og autoklaveværktøjer 1 dag før kromaffincellekultur.
- Få kvæg binyrerne fra et lokalt slagteri på kulturdagen, og hold dem nedsænket i iskold Lockes opløsning før dissektion.
BEMÆRK: Binyrerne er fra 21-27 måneder gamle, sunde, sorte Angus af begge køn (hovedsageligt mandlige) med kropsvægt omkring 1.400 pund (~ 635 kg). - Forbered 30 ml (til 3 binyrerne) frisk enzymopløsning indeholdende collagenase P, trypsinhæmmer og bovint serumalbumin (tabel 1) før dissektion og opbevar det ved stuetemperatur.
- Vælg 3 intakte kirtler uden snit eller blødninger på overfladen, og fjern fedtvævet med en saks (figur 1A). Vask kirtlerne ved perfusion med Lockes opløsning, indtil der ikke kommer blod ud. For at opnå dette skal du puste kirtlen op gennem binyrevenen (figur 1B) ved hjælp af en 30 ml sprøjte fastgjort med et 0,22 μm filter så mange gange som nødvendigt25.
BEMÆRK: Ca. 150 ml Lockes opløsning er normalt nødvendig for at vaske 3 kirtler. - Til fordøjelse injiceres enzymopløsningen gennem binyrevenen ved hjælp af en 30 ml sprøjte fastgjort med et 0,22 μm filter, indtil kirtlen begynder at svulme. Lad derefter kirtlerne stå ved 37 °C i 10 min. Injicer igen, og lad kirtlerne stå ved 37 °C i yderligere 10 minutter.
BEMÆRK: Ca. 30 ml enzymopløsning er nødvendig for at fordøje 3 kirtler. - Efter fordøjelsen skæres kirtlen i længderetningen fra venen til den anden ende med en saks for at udfolde kirtlen (figur 1C). Isoler medullaen ved at pincet den hvide medulla ud i en 10 cm petriskål indeholdende Lockes opløsning.
BEMÆRK: Sammenligningen af det indre af kirtlen før og efter fordøjelsen er vist i figur 1C. Detaljerne om fordøjelsen og medullae isolation er rapporteret tidligere23,25. - Skær og hak medulla i små stykker med en saks (figur 1D). Medullaophænget filtreres med et 80-100 μm nylonnet i et bægerglas. Derefter overføres filtratet til et 50 ml konisk rør til centrifugering ved 48 × g stuetemperatur i 3 minutter med deceleration på 3.
BEMÆRK: Hakningen af medullae tager normalt ~ 10 minutter. For at opnå et godt udbytte af celler skal de hakkede stykker være meget små, indtil de ikke kan pincet op. - Efter centrifugering fjernes supernatanten, og cellepelleten resuspenderes med Lockes opløsning ved pipettering. Cellesuspensionen filtreres med en sil på 80-100 μm, og centrifuger ved 48 x g stuetemperatur i 3 minutter med deceleration på 3.
- Supernatanten fjernes, og cellepillen resuspenderes med 30 ml kulturmedium (tabel 1). Bestem cellenummeret ved hjælp af hemacytometertællingskamre25.
2. Transfektion med elektroporation
- Overfør 2,8 × 106 celler til et 15 ml rør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 48 × g i 2 min med deceleration på 3. Der tilsættes 100 μL transfektionsbuffer (se materialetabellen) fra fabrikanten til cellepillen, og der tilsættes derefter 2 μg PH-mNG-plasmidet.
BEMÆRK: PH-mNG-plasmidet blev skabt ved at erstatte det forbedrede grønne fluorescerende protein (EGFP) med mNG i PH-EGFP15 (se materialetabellen). - Bland forsigtigt suspensionen ved at pipettere opløsningen op og ned, og overfør blandingen straks til en elektroporationskuvette (figur 1E). Overfør straks kuvetten til elektroporatoren (se materialetabellen), vælg O-005-programmet på skærmlisten, og tryk på Enter for at udføre elektroporation.
BEMÆRK: Forbered cellesuspensionen til transfektion i en cellekulturhætte. Indfør ikke luftbobler i suspensionen under blandingstrinnet. Fortsæt straks til næste trin. - Efter elektroporation tilsættes 1,8 ml medium straks til kuvetten og blandes forsigtigt med en mikropipettor udstyret med en steril spids. Derefter tilsættes 300 μL af suspensionen af de elektroporerede celler oven på dækslippen (se materialetabellen) i hver skål, plettering 5-6 retter i alt for en elektroporationsreaktion.
- Overfør forsigtigt opvasken til en befugtet inkubator ved 37 ° C med 9% CO2 i 30 minutter, og tilsæt forsigtigt 2 ml forvarmet medium til hver skål efter 30 minutter.
- De transinficerede celler opbevares i den befugtede inkubator ved 37 °C med 9 % CO2 i 2-3 dage før forsøget.
BEMÆRK: De dyrkede celler holder i en uge. Det er bedst at bruge dyrkede celler på dag 2-3.
3. Forberedelse til patch-clamp optagelse og konfokal billeddannelse
BEMÆRK: Denne protokol blev udført med et laserscanning konfokalt mikroskop og patch-clamp forstærker med spændingsklemmeoptagelse sammen med en lock-in forstærker til kapacitansoptagelse. En XY-plan konfokal billeddannelse ved et fast Z-plan (XY / Zfast scanning) blev brugt til at afbilde alle tre fluorescerende signaler samtidigt. Z-planet var fokuseret på cellebunden, hvor plasmamembranen klæbede til dækslerne.
- På dagen for patch-clamp og imaging eksperimentet observeres cellerne under et fluorescensmikroskop. Brug brightfield til at sikre, at cellekulturen ikke er forurenet (figur 1F) og epifluorescens for at kontrollere, om det fluorescerende mærkede protein er korrekt udtryk.
BEMÆRK: For eksempel udtrykkes PH-mNG ved plasmamembranen på ~ 20-30% af cellerne. - Forbered plasterpipetter fra borosilikatglaskapillærer. For at gøre dette skal du trække pipetterne med en pipettetrækker, belægge deres spidser med flydende voks og polere dem med en mikroforge (se materialetabellen).
- Tænd for patch-clamp-optageforstærkeren, og start patch-clamp-optagelsessoftwaren (se materialetabellen). Indstil de relevante parametre for calciumstrøm og kapacitansregistrering i softwaren (se materialetabellen).
- Indstil en optagelsesprotokol på 60 s varighed i alt, hvor stimuleringen starter ved 10 s.
- Indstil holdepotentialet for spændingsklemmeoptagelse til -80 mV. Indstil en 1 s depolarisering fra -80 mV til 10 mV som stimulans for at inducere calciumtilstrømning og kapacitansspring.
- For kapacitansmålinger indstilles frekvensen af sinusformet stimulus til et interval på 1.000-1.500 Hz med en peak-to-peak spænding på højst 50 mV.
- Gem protokollen, og opret en ny fil til optagelse.
- Tænd for det konfokale mikroskopsystem, og indstil de relevante parametre i softwaren (se materialetabellen).
- Tænd laserne, inklusive 458 nm, 514 nm og 633 nm, og indstil emissionsopsamlingsområdet for hver laser i henhold til hver fluorescenssonde som i det følgende. FFN511: excitationsbølgelængde (EX), 458 nm; emissionsbølgelængde (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Brug sekventiel billeddannelse til FFN511 og mNG for at undgå krydstale mellem disse to sonder. Indstil en timelapse på 1 minuts varighed til billedoptagelse (figur 1G).
4. Patch-clamp optagelse og konfokal billeddannelse
- Vælg en skål med god celletilstand og korrekt udtryk, og tilsæt 2 μL fluorescerende falsk neurotransmitter FFN511 (10 mM lager, 1: 1.000 arbejdsløsning) i mediet. Sæt skålen tilbage i inkubatoren i 20 min. Alternativt kan du indlæse FFN511 efter trin 3.2 og udføre trin 3.3-3.5, mens du venter på at spare tid.
- Når FFN511-indlæsningen er færdig, forberedes optagekammeret og tilsættes 2 μL fluorescerende farvestof A655 til 500 μL af badeopløsningen (figur 2A og tabel 1). Dækslippen fra fadet overføres til optagekammeret (se materialetabellen) med en pincet, og der tilsættes straks A655-holdig badeopløsning (figur 2B).
BEMÆRK: A655 opbevares i -20 °C med en koncentration på 10 mM, og arbejdskoncentrationen er 40 μM.
FORSIGTIG: Brug handsker for at undgå direkte hudkontakt med FFN511 eller A655. - Anbring en dråbe olie (brydningsindeks: 1.518; se materialetabellen) på målet 100x oliesænkning (numerisk blænde = 1,4). Monter kammeret i mikroskopet, og brug justeringsknappen til at få olien til bare at komme i kontakt med bunden af dækslippen, og nedsænk derefter jordtrådsspidsen i badeopløsningen (figur 2C, D).
BEMÆRK: Vælg en nedsænkningsolie, der er egnet til arbejde ved stuetemperatur. Det er unødvendigt at skifte mellem objektivet med lav og høj forstørrelse. Rumtemperaturen holdes omkring 20-22 °C under optagelsen. - Bring cellerne i fokus og brug brightfield og confocal billeddannelse til at finde en god celle med mNG-udtryk. Zoom ind på den markerede celle, og juster den til midten af visningen for at minimere tomme områder.
BEMÆRK: Den skematiske tegning af fluorescensmærkning er vist i figur 3A. En god celle har normalt en glat membran og ren kant (figur 3B). Med epifluorescens eller konfokal billeddannelse ser en god celle ud til at have en stor og flad bund med lyst mNG-udtryk (figur 3C).
Pixelstørrelsen er ~ 50 nm inden for et interval på ~ 40-80 nm i henhold til forskellig cellestørrelse og zoomfaktor. - Konfigurer parametre for XY-plan konfokal billeddannelse ved et fast Z-plan (XY/Zfast scanning) af FFN511, PH-mNG og A655 med et minimeret tidsinterval. Juster fokus til bunden af cellen med finjusteringsknappen.
BEMÆRK: PH-mNG signalerer konturen af celleplasmamembranen ved den konfokale XY-plankrydssektion (undtagen cellebunden). Nær cellemembranbunden kan der observeres A655-pletter, som afspejler Ω- eller A-formmembraninvaginationer. Hvis Z-brændplanet er lavere end cellebunden, bliver intensiteten af al fluorescens svagere. - Juster excitationslasereffekten i softwaren for at finde en indstilling for at få det bedste signal-støj-forhold og undgå betydelig fluorescensblegning. For at gøre dette skal du starte med en indledende testværdi på 2,5 mW effekt for FFN511 exciteret ved 458 nm og 1 mW for mNG exciteret ved 514 nm. For A655-spænding ved 633 nm med en HeNe-laser skal du bruge høj lasereffekt, ~ 12-15 mW (dvs. 70% -80% af maksimumet), som ved kontinuerlig excitation kan blege al fluorescerende A655 inde i en Ω-formprofil, når dens pore er lukket.
BEMÆRK: Hvis lasereffekten er for høj, bleges PH-mNG og FFN511 fluorescens hurtigt. Hvis lasereffekten er for lav, vil signalerne være for svage eller støjende til at blive analyseret. - Der tilsættes 9 μL intern opløsning (tabel 1) i en plasterpipette, og pipetten fastgøres til holderen i patch-clamp forstærkertrinnet (se materialetabellen).
- Påfør en lille mængde positivt tryk med en sprøjte og flyt pipettespidsen for at røre badeopløsningen med en mikromanipulator. Sørg for, at forstærkeren viser, at pipettemodstanden er ~2-4 MΩ med en spændingsimpulstest. Tryk på LJ/Auto for at annullere væskekrydset.
- Flyt pipetten mod den valgte celle med mikromanipulatoren. For at danne en celletilsluttet tilstand skal du flytte pipettespidsen for at røre ved cellen (modstanden øges); påfør undertryk forsigtigt med sprøjten (modstanden øges til mere end 1 GΩ), skift holdepotentialet fra 0 til -80 mV.
- Når modstanden passerer 1 GΩ, skal du vente på ~ 30 s, før konfigurationen stabiliseres. Tryk på C-fast/Auto for at kompensere for hurtig kapacitans.
- For at danne en helcelletilstand påføres pulserende kort, men kraftigt undertryk med sprøjten for at sprænge membranen (formen på den aktuelle puls ændres med en ladet og afladet membrankondensator). Tryk på C-slow/Auto for at kompensere for langsom kapacitans.
- Juster billedfokus lidt for at fokusere på cellebunden. Start confocal timelapse-billeddannelse og patch-clamp-optagelse samtidigt ved at klikke på Start-knapperne i de to forskellige softwareapplikationer på samme tid.
BEMÆRK: Den konfokale billedbehandlingssoftware laver en film med en hastighed på ~ 20-90 ms / ramme. Patch-clamp-optagelsen inkluderer hviletilstanden i 10 s, 1 s depolariseringsstimulering og yderligere 49 s efter stimulering. Patch-clamp-konfigurationen tillader registrering af calciumstrøm, kapacitansspring og henfald induceret af 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV (figur 3D). - Når optagelsen er afsluttet, skal du sørge for, at dataene gemmes. Skift holdepotentialet tilbage til 0 mV. Flyt pipetten ud af badeopløsningen, og kassér den.
- Gentag trin 4.7-4.13 for at optage en anden celle i skålen. Efter 1 times optagelse skal du skifte til en anden skål til optagelse.
BEMÆRK: Efter 1 times optagelse falder succesraten for patch-clamp-optagelse betydeligt. For at øge effektiviteten af dataindsamling anbefales registrering i kun 1 time i hver skål.
5. Analyse af patch-clamp data
- Åbn relevant software (se materialetabellen) til dataanalyse. Klik på PPT-| Indlæse PULSE-fil | Filknapper til at indlæse .dat filen. Klik på Gør det , og fire spor afbildes automatisk i en graf inklusive calciumstrøm og kapacitansspor.
- Klik på Windows | Knappen Ny graf , vælg Pulse_1_1_1, den første bølge i Y Wave(s), og klik på Gør det for at plotte calciumstrømsgrafen. Klik på Windows | Knappen Ny tabel , vælg Pulse_1_1_1, og klik på Gør det for at få vist rådata for calciumstrøm, som kan bruges til at plotte det gennemsnitlige spor af flere celler.
- Tegn en firkant i overensstemmelse hermed i calciumstrømgrafen, højreklik og udvid det aktuelle signal til at omfatte basislinjen og toppen af calciumstrømmen. Klik på Graf | Vis oplysninger for at vise markører A og B og flytte dem til henholdsvis grundlinjen og toppen. Grafoplysningerne vises i bunden, og parametrene kan estimeres.
- Gentag trin 5.2, men vælg Pulse_1_1_1_Cm, den anden bølge i Y Wave(s), for at afbilde kapacitanssporet. Gentag trin 5.3, og placer A- og B-markøren i den relevante position for at måle kapacitansparametrene, såsom baseline, amplitude og henfaldshastighed.
- Kopier rådata i trin 5.2 til et regneark, beregn middel- og standardfejlen for middelværdien for en gruppe registrerede celler, og plot de gennemsnitlige spor af calciumstrøm og membrankapacitans (figur 3E) i en passende software.
6. Analyse af konfokal billeddannelsesdata
- Åbn raw imaging-filerne med software leveret af producenten (se materialetabellen).
BEMÆRK: Nogle andre gratis programmer, såsom ImageJ eller Fiji, kan bruges til databehandling og kvantificering af de billeder, der er opnået i afsnit 4. - Klik på Proces | ProcessTools og brug værktøjerne til at generere rullende gennemsnit (f.eks. Rullende gennemsnit for hvert 4 billeder) filer for hvert timelapse-billede og gemme disse filer.
BEMÆRK: Efter rullende gennemsnit kan der foretages passende justering af lysstyrken og baggrunden for at vise fluorescensændringerne i tre kanaler bedre, hvilket kan hjælpe med at identificere fusionshændelser. Kontrol af fluorescerende intensitet i nogle regioner uden fusionshændelse kan hjælpe med at skelne det fluorescerende signal fra fusionshændelser fra baggrundssignaler. - Klik på knapperne Kvantificer | Værktøjer | Stakprofil, kontroller tidspunkter før og efter stimulering for at identificere fluorescensændringer i hver kanal. Klik på knappen Tegn ellipse for at cirkulere de interesseområder (ROI'er) for fusionsbegivenheder. Højreklik på billedet, og klik på Gem RIE'er for at gemme RI'erne.
BEMÆRK: Størrelsen af ROI, som dækker alle de tre fluorescerende signaler, var ens med vesikelstørrelse i chromaffinceller24. Rådata blev brugt til analysen, mens de rullende gennemsnitsdata, der øger signal/støj-forholdet, blev leveret for tydeligt at vise de tre signaler. - Klik på Åbn projekter for at finde den rå fil, højreklik på billedet, og klik på Indlæs ROI'er for at indlæse ROI-filen i raw-billedfilerne for at måle fluorescensintensiteten.
BEMÆRK: Det rå fluorescerende signal vil blive brugt til at plotte spor af forskellige kanaler. For hvert investeringsafkast defineres basislinjen som intensiteten før stimulering, og intensitetssporene kan normaliseres til baseline. - Klik på Værktøjer | Sorter ROI'er i softwaren, og plot sporene for alle tre kanaler for hver ROI. Klik på Rapportér for at gemme ROI-dataene, herunder både digitale data og billedsporinger for hvert investeringsafkast, i en filmappe.
- Identificer en fusionshændelse ved den samtidige stigning i intensiteten af PH-mNG (FPH) og A655 (F655) pletfluorescens (inden for en enkelt ramme) ledsaget af et fald i FFN511-pletfluorescens (FFFN).
- Se efter udseendet af FPH og F655, hvilket indikerer PH-mNG / A655-spotdannelse på grund af en Ω-profil genereret ved fusion, hvilket muliggør diffusion af PH-mNG fra plasmamembranen og vedvarende diffusion af A655 fra badet.
- Se efter FFFN-fald , hvilket indikerer dets frigivelse fra en vesikel på grund af fusionsporeåbning og udelukker muligheden for, at FPH og F655 udseende kan være fra membraninvagination forårsaget af endocytose.
- Undersøg timelapse XY/Zfaste billeder, der viser fusionshændelser, der sker på cellebunden. Analyser tre former for fusionshændelser: 1) tæt fusion, 2) opholdsfusion og 3) krympefusion.
BEMÆRK: Fusionshændelser blev sjældent observeret før depolarisering, mens snesevis af fusionshændelser kunne observeres efter depolarisering. Efter fusion kan Ω-profilen lukke sin pore, opretholde sin åbne pore eller krympe for at fusionere ind i plasmamembranen.- For at identificere nærfusion skal du kigge efter dæmpning af F655 , fordi fusionsporelukning forhindrer udveksling af bad A655, mens FPH opretholder, hvilket afspejler den fortsatte omdannelse af PtdIns (4,5) P2 til PtdIns (4) P, eller FPH henfalder med en forsinkelse, hvilket afspejler vesikel-pinch-off (nærfusion, figur 4A, B).
- Se efter vedvarende FPH og F655 for at identificere opholdsfusion (figur 4C).
- Se efter parallelle fald i FPH og F655, hvilket indikerer Ω-profilkrympning for at identificere krympefusion (figur 4D).
BEMÆRK: Kontroller de originale billedfiler for at inspicere billedsporene, hvis de er usikre på hændelsestypen. Kontrol af den fluorescerende intensitet i nogle regioner uden fusionshændelse kan hjælpe med at skelne det fluorescerende signal fra fusionshændelser fra baggrundssignaler.
- Plot repræsentative spor af intensitetsændringer for disse tre kanaler: FFN511, PH-mNG og A655. Kvantificer procentdelen af forskellige fusionstilstande i hver celle og plottal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de eksperimentelle procedurer vist i figur 1 og figur 2 blev chromaffinceller fra kvæg binyrerne transficeret med PH-mNG for at mærke plasmamembranen; A655 blev tilføjet til badeopløsningen for at detektere lukning af fusionsporer; og fluorescerende falsk neurotransmitter FFN511 blev indlæst i vesikler til påvisning af frigivelse. Dernæst blev XY-plan konfokal timelapse billeddannelse af FFN511, PH-mNG og A655 udført hver 20-90 ms i cellebunden (Z-brændplan ~ 100-200 nm over cellemembranen). Helcelle patch-clamp optagelse og anvendelse af en 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV blev udført for at fremkalde exo- og endocytose (figur 3A-C). Denne depolarisering inducerede en indadgående calciumstrøm, et kapacitansspring, der indikerer exocytose, og et kapacitanshenfald efter springet, der indikerer endocytose (figur 3D, E).
Med timelapse XY/Zfast billeddannelse i cellebunden blev mange individuelle fusionshændelser observeret 8,24 efter depolarisering (figur 4A), mens sjældne fusionshændelser blev observeret før depolarisering. Fusionshændelser induceret af 1 s depolariseringsprotokollen blev identificeret som FFN511 spot fluorescens (FFFN) fald, der afspejler FFN511-frigivelse, ledsaget af FPH og A655 spotfluorescens (F655) stigning, der afspejler PH-mNG og A655 diffusion fra plasmamembranen og badopløsningen ind i fusionsversiklen (den fusionsgenererede Ω-profil)15.
Efter fusion kan den Ω-profil, der genereres ved vesikelfusion med plasmamembranen, 1) lukke sin pore, kaldet tæt fusion, 2) opretholde en åben fusionspore, kaldet stay-fusion, eller 3) krympe for at fusionere ind i plasmamembranen, kaldet krympefusion. Nærfusion blev identificeret som F655-dæmpning, mens FPH opretholdt eller henfaldt med en forsinkelse (figur 4B). Stay-fusion blev påvist som vedvarende tilstedeværelse af både PH-mNG og A655 pletter (figur 4C). Krympefusion blev påvist som parallelt FPH- og F655-henfald ledsaget af en parallel størrelsesreduktion af PH-mNG-pletten og A655-pletten (figur 4D)8,15,16,24.
Figur 1: Skematisk repræsentation af den eksperimentelle protokol. (A, B) Kvæg binyrerne trimmes med en saks for at fjerne fedtvæv (A), skylles med Lockes opløsning og fordøjes gennem binyrevenen (B). (C) Det indre af en binyre uden fordøjelse (venstre) eller efter korrekt fordøjelse (højre). (D) Efter vask og fordøjelse isoleres medullaen og hakkes i små stykker, og kromaffinceller adskilles fra hakket medullae efter filtrering og centrifugering. (E) Chromaffinceller elektroporeres og belagt på dækslips til inkubation. (F) På dag 2-3 kontrolleres kromaffincellerne under et mikroskop, før de eksperimenterer. (G) Celleprøven er indlejret i kammeret til patch-clamp-optagelse og konfokal billeddannelse. Calciumstrøm og kapacitansændringer registreres, forstærkes og vises på skærmen. Fluorescensændringer ved stimulering registreres og vises på skærmen. Skalastænger = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Patch-clamp og confocal opsætning. (A) På forsøgsdagen inkuberes chromaffincellerne dyrket på dækslips med FFN511 i 20 min. Farvestoffet A655 tilsættes til badeopløsningen. (B) Chromaffinceller på dækslippen overføres til et optagekammer, og badeopløsningen med A655 tilsættes til kammeret. (C) Efter tilsætning af en dråbe olie på 100x oliesænkningsmålet monteres kammeret på scenen i et omvendt konfokalt mikroskop. Spidsen af jordledningen er nedsænket i badeopløsning. Pipetten bringes på plads efter påfyldning med pipetteopløsning og holdes af en pipetteholder, der er fastgjort til et hovedsæt. Hovedscenen styres af en motoriseret mikromanipulator. (D) Når du har fundet en god celle, flyttes pipettespidsen ind i badeopløsningen med mikromanipulatoren for at starte helcelle patch-clamp-optagelse og konfokal billeddannelse. Vægtstænger = 10 mm (A), 5 mm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Helcellespændingsklemmeoptagelser af calciumstrømme og kapacitansændringer induceret af depolarisering. (A) Opsætningstegning af kromaffinceller under helcellespændingsklemmeoptagelse. Kromaffincellen nedsænkes i A655-holdig badeopløsning (rød), og cellemembranen og vesiklerne er mærket med henholdsvis PH-mNG (grøn) og FFN511 (cyan). Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra 24. (B) Et repræsentativt billede af en patch-fastspændt kromaffincelle observeret af brightfield. (C) Repræsentative billeder af PH-mNG (grøn), A655 (rød) og FFN511 (cyan) i en celle med godt fokus på cellefodaftrykket. (D) Et eksempel på calciumstrøm og kapacitansændringer induceret af 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV. (E) De gennemsnitlige spor af calciumstrømme (ICa) og kapacitansændringer (Cm) indsamlet fra 20 kromaffinceller. Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra 26. Skalastænger = 5 μm (B, C). Forkortelser: ICa = calciumstrøm; Cm = kapacitans; Depol = depolarisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visualisering af fusionshændelser under det konfokale mikroskop. (A) Mange fusionspletter kan detekteres med konfokal XY-planbilleddannelse af PH-mNG (grøn), A655 (rød) og FFN511 (cyan) i cellebunden. Fusion blev fremkaldt af en 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV (depol1s). FFN-pletter gennemgik frigivelse og tæt fusion (cirkler). Billeder før (-1 s) og efter (+1 s og +10 s) depolarisering vises. (B) Et eksempel på tæt fusion. (C) Et eksempel på stay-fusion. (D) Et eksempel på krympefusion. Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra 24. Skalastænger = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Forkortelser: Depol = depolarisering; F = fluorescerende intensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medium/løsning | Beskrivelse | ||
| Lockes løsning | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM glucose og 10 mM HEPES, pH 7,3, justeret med NaOH | ||
| Enzym opløsning | 1,5 mg/ml collagenase P, 0,325 mg/ml trypsinhæmmer og 5 mg/ml bovint serumalbumin i Lockes opløsning | ||
| Kultur medium | DMEM-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum | ||
| Intern løsning | 130 mM Cs-glutamat, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP og 0,5 mM GTP, pH 7,2, justeret med CsOH | ||
| Bad løsning | 125 mM NaCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl og 20 mM TEA, pH 7,3, justeret med NaOH | ||
Tabel 1: Detaljer om sammensætningen af kulturmedium og opløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En konfokal mikroskopisk billeddannelsesmetode er beskrevet for at detektere dynamikken i fusionspore og transmitterfrigivelse samt tre fusionstilstande, tæt fusion, opholdsfusion og krympefusion i bovin adrenalchromffinceller 4,24. En elektrofysiologisk metode til at depolarisere cellen og derved fremkalde exo- og endocytose er beskrevet. Systematisk konfokal billedbehandling giver information om forskellige former for poreadfærd for fusions- og fissionshændelser.
Samtidig overvågning af calciumstrøm og kapacitansændringer i samme celle med helcellekonfigurationen giver yderligere information om exo- og endocytose, hvilket indebærer forholdet mellem poreåbning og lukning på helcelleniveau til enhver tid. Disse metoder kan i princippet anvendes på andre excitable celler og ikke-elektrisk excitable celler i primær kultur eller i cellelinjer indeholdende vesikler på ~ 200-1.600 nm15. Ud over kromaffinceller er den her beskrevne metode blevet anvendt på en rotte pancreas beta-cellelinje, INS-1 celler4.
I princippet kan metoden også anvendes på sekretoriske celler indeholdende vesikler mindre end 200 nm. Men da vesikelstørrelsen reduceres, kan signal-støj-forholdet være for lavt til pålidelig detektion. Superopløsningsbilleddannelse i stedet for konfokal billeddannelse kan blive nødvendig. Hidtil er de metoder, der er beskrevet her, ikke blevet anvendt på synapser indeholdende ~ 40 nm synaptiske vesikler.
En vellykket implementering af den metode, der er beskrevet her, afhænger kritisk af flere generelle trin, såsom kulturcellekvalitet, plasmidtransfektionseffektivitet og succesrate for elektrofysiologisk registrering. For det første er sunde celler afgørende for både patch-clamp-optagelse og konfokal billeddannelse. Det anbefales ikke at anvende antibakterielle eller antifungale midler under dyrkning, fordi disse kemikalier kan påvirke kromaffincellernes excitabilitet. Således er flittig udøvelse af steril teknik og brug af frisklavede medier vigtige. Selvom primære kulturkromaffinceller kan overleve i retter i mindst en uge25, er det vigtigt for nye brugere at bruge celler på dag 2 til 3 til forsøgene. Efterhånden som fibroblaster vokser gradvist, bliver det vanskeligere at etablere helcelle patch-clamp-konfigurationen. For det andet er elektroporationseffektiviteten af plasmider i chromaffinceller ca. 20-30%. Elektroporationseffektiviteten skal optimeres, hvis den er for lav, eller PH-mNG-fluorescensen er for svag. For det tredje blev celler afbildet i bunden med et 100x oliemål for at opnå væsentlige begivenheder indikeret ved ændringer i tre fluorescerende sonder: FFN511, PH-mNG og A655. Selvom DIC giver et klarere billede end lysfelt eller billeddannelse med det blotte øje, når helcellekonfigurationen etableres, er enhver visualiseringsteknik, der giver brugeren mulighed for at etablere konfigurationen, tilstrækkelig.
Passende laserkraftstyrke er afgørende for konfokal billeddannelse i levende celler. Da FFN511 og mNG kan bleges med høj lasereffekt, er det bedre at kigge efter en god celle med epifluorescens før visualisering med konfokale lasere. For A655 er højeffekt laser excitation nødvendig for at blege farvestoffet inde i vesiklerne. Derudover er den mest almindelige årsag til, at dette eksperiment ikke lykkes, en fejl i patch-clamp-optagelse. En ren og poleret pipettespids af den rette størrelse og praksis, der genererer helcellekonfigurationen på kromaffinceller, er nøglefaktorer. Selvom det kan tage lidt tid og kræfter at lykkes, giver disse eksperimenter, når de først er etableret, betydelige data vedrørende både fusions- og fissionshændelser, hvilket indikerer åbning og lukning af membranporer på et enkelt begivenhedsniveau.
Protokollen beskrevet her kan bruges med nogle ændringer til yderligere forskellige eksperimentelle mål. Uanset eksperimentelle mål er det imidlertid tilrådeligt først at anvende høj kaliumopløsning (såsom 70 mM KCl) som en stimulans for at se de ændringer, membranen gennemgår, når den depolariseres, hvilket sikrer, at intensitetsændringerne i disse tre farvestoffer, FFN, PH og A655, kan visualiseres. Plasmamembranen kan mærkes med andre membranbindende fluoroforer, såsom mCLING (membranbindende fluorofor-cystein-lysin-palmitoylgruppe)4,27 eller CAAX (et proteinmotiv, der er målrettet mod cytosol-face plasmamembran via cysteinrest isoprenylering)4,28. A655 kan erstattes med andre farvestoffer med forskellige spektre, såsom Atto 532 (A532), afhængigt af kombinationen af fluorescerende molekyler, der anvendes i visse forsøg15. Neuropeptid Y kan anvendes i stedet for fluorescerende falske neurotransmittere16.
FFN511 blev ophidset ved 458 nm i stedet for 405 nm i dette eksperiment, selvom det maksimale excitationsspektrum for FFN511 er omkring 405 nm. Undersøgelse med kapacitansregistrering viste ingen signifikant forskel i chromaffinceller med eller uden PH-mNG, hvilket indikerer, at overekspression af PH-mNG ikke påvirker exocytose og endocytose15,24. Lignende procentdele for fusionshændelser blev verificeret i kromaffinceller mærket med PH-mNG og A532 kun eller med FFN511, hvilket viser, at indlæsning af FFN511 i chromaffinvesikler ikke påvirker indholdsfrigivelsen og forskellige fusionstilstande16. 1 s depolariseringsstimulering kan erstattes af høj kaliumopløsning eller andre pattens af depolarisering. Disse ændringer kan bruges til at tilpasse sig forskellige eksperimentelle mål.
På trods af fordelene ved denne kraftfulde metode har den nogle begrænsninger. Den største begrænsning er relateret til den diffraktionsbegrænsede opløsning (~ 230 nm) af konfokal mikroskopi, som kan overvindes ved mere avancerede superopløsningsmikroskopiteknikker29. Granulatdiameteren i bovin kromaffinceller er ~ 300 nm6, hvilket gør det muligt at observere membranporeåbning og lukning inden for den rumlige opløsning af konfokal mikroskopi. Imidlertid er synaptiske vesikler ~ 30-60 nm30, hvilket er ud over konfokal opløsning. Udvidelse af disse levende cellebilleddannelsesmålinger til små synaptiske vesikler viser sig at være vanskeligt med konfokal billeddannelse.
Levende cellebilleddannelsesteknikker med bedre tidsmæssig og / eller rumlig opløsning, såsom STED-mikroskopi, stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi og minimal fotonfluxes (MINFLUX) nanoskopi er blevet udviklet og kan anvendes på denne metode 31,32,33,34 . Faktisk er STED-mikroskopi blevet brugt til at afsløre fusionsporedynamik i kromaffinceller. De forskellige former for fusionshændelser og præformet Ω-profillukning kan verificeres yderligere ved hjælp af superopløsningsmikroskopi såsom STED-mikroskopi24. Andre begrænsninger omfatter fotobleaching og cytotoksicitet af fluorescerende proteiner og farvestoffer.
Denne kombination af elektrofysiologi og konfokal mikroskopi kan anvendes bredt på mange sekretoriske celler. Kombinationen af superopløsningsmikroskopi med de metoder, der er beskrevet her, ville være et værdifuldt værktøj til måling af fusionsporedynamik i neurale kredsløb i fremtiden, forudsat at superopløsningsmikroskopi vil udvikle sig i en sådan grad, at den kan løse fusionsporen ved nerveterminaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 og ZIA NS003105-08) for at støtte dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C.
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al.
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O'Connor, D. T., et al.
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al.
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
