Summary
Detta protokoll beskriver en konfokal avbildningsteknik för att detektera tre fusionslägen i bovina binjurekromaffinceller. Dessa fusionslägen inkluderar 1) nära fusion (även kallad kiss-and-run), som involverar fusionsporöppning och stängning, 2) stay-fusion, som involverar fusionsporöppning och underhåll av den öppnade poren, och 3) krympfusion, som involverar smält vesikelkrympning.
Abstract
Dynamisk fusionsporöppning och stängning förmedlar exocytos och endocytos och bestämmer deras kinetik. Här demonstreras det i detalj hur konfokalmikroskopi användes i kombination med patch-clamp-inspelning för att detektera tre fusionslägen i primärkulturen bovina binjurekromaffinceller. De tre fusionslägena inkluderar 1) nära fusion (även kallad kiss-and-run), som involverar fusionsporöppning och stängning, 2) stay-fusion, som involverar fusionsporöppning och underhåll av den öppnade poren, och 3) krympfusion, vilket involverar krympning av den fusionsgenererade Ω-formprofilen tills den smälter samman helt vid plasmamembranet.
För att detektera dessa fusionslägen märktes plasmamembranet genom att överuttrycka mNeonGreen fäst med PH-domänen för fosfolipas C δ (PH-mNG), som binder till fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2) vid plasmamembranets cytosolvända bipacksedel; vesiklar laddades med den fluorescerande falska neurotransmittorn FFN511 för att detektera frisättning av vesikulärt innehåll; och Atto 655 ingick i badlösningen för att detektera fusionsporförslutning. Dessa tre fluorescerande sonder avbildades samtidigt vid ~ 20-90 ms per bildruta i levande kromaffinceller för att detektera fusionsporöppning, innehållsfrisättning, fusionsporstängning och smältande vesikelstorleksförändringar. Analysmetoden beskrivs för att skilja tre fusionslägen från dessa fluorescensmätningar. Metoden som beskrivs här kan i princip tillämpas på många sekretoriska celler bortom kromaffinceller.
Introduction
Membranfusion förmedlar många biologiska funktioner, inklusive synaptisk överföring, blodsockerhomeostas, immunsvar och viral inträde 1,2,3. Exocytos, som involverar vesikelfusion vid plasmamembranet, frigör neurotransmittorer och hormoner för att uppnå många viktiga funktioner, såsom neuronala nätverksaktiviteter. Fusion öppnar en por för att frigöra vesikulärt innehåll, varefter poren kan stänga för att hämta den smältande vesikeln, som kallas kiss-and-run 1,4. Både irreversibel och reversibel fusionsporöppning kan mätas med cellbundna kapacitansinspelningar i kombination med fusionsporkonduktansinspelningar av enkel vesikelfusion.
Detta tolkas ofta som att det återspeglar fullkollapsfusion, som involverar utvidgning av fusionen tills utplattning av den smältande vesikeln, och kyss-och-kör, som involverar fusionsporöppning respektive stängning 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nyligen genomförda konfokala och stimulerade emissionsutarmningsstudier (STED) i kromaffinceller observerade direkt fusionsporöppning och stängning (kiss-and-run, även kallad nära fusion), fusionsporöppning som upprätthåller en Ω-form med en öppen por under lång tid, kallad stay-fusion och krympning av den smältande vesikeln tills den är fullständig sammanfogad med plasmamembranet, som ersätter fullkollapsfusion för att smälta samman smältande vesiklar med plasmamembranet4, 8,14,15,16,17.
I nervceller har öppning och stängning av fusionsporer detekterats med avbildning som visar frisättningen av kvantprickar förinstallerade i vesiklar som är större än fusionsporen och med fusionsporkonduktansmätningar vid frisättningsytan på nervterminalerna 5,18,19. Binjurekromaffinceller används ofta som en modell för studier av exo- och endocytos20,21. Även om kromaffinceller innehåller stora tätkärniga vesiklar, medan synapser innehåller små synaptiska vesiklar, är exocytos- och endocytosproteinerna i kromaffinceller och synapser ganska analoga 10,11,12,20,21,22,23.
Här beskrivs en metod för att mäta dessa tre fusionslägen med hjälp av en konfokal avbildningsmetod i kombination med elektrofysiologi i bovina binjurekromaffinceller (figur 1). Denna metod innefattar laddning av fluorescerande falska neurotransmittorer (FFN511) i vesiklar för att detektera exocytos; tillsats av Atto 655 (A655) i badlösningen för att fylla den fusionsgenererade Ω-formprofilen och märkning av plasmamembranet med PH-domänen för fosfoglias C δ (PH), som binder till PtdIns(4,5)P2 vid plasmamembranet 8,15,24. Fusionspordynamik kan detekteras genom förändringar i olika fluorescerande intensiteter. Även om det beskrivs för kromaffinceller kan principen för denna metod som beskrivs här tillämpas i stor utsträckning på många sekretoriska celler långt bortom kromaffinceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Djuranvändningsförfarandet följde NIH-riktlinjerna och godkändes av NIH Animal Care and Use Committee.
1. Bovin kromaffincellodling
- Förbered Lockes lösning (tabell 1) och autoklavverktyg 1 dag före kromaffincellodling.
- Skaffa nötkreatur binjurar från ett lokalt slakteri på kulturdagen och håll dem nedsänkta i iskall Lockes lösning före dissektion.
OBS: Binjurarna är från 21-27 månader gamla, friska, svarta Angus av båda könen (främst manliga) med kroppsvikt runt 1,400 pund (~ 635 kg). - Förbered 30 ml (för 3 binjurar) av färsk enzymlösning innehållande kollagenas P, trypsinhämmare och bovint serumalbumin (tabell 1) före dissektion och håll den vid rumstemperatur.
- Välj 3 intakta körtlar utan snitt eller blödningar på ytan och ta bort fettvävnaden med sax (figur 1A). Tvätta körtlarna genom perfusion med Lockes lösning tills inget blod kommer ut. För att uppnå detta, blåsa upp körteln genom binjuren (figur 1B) med en 30 ml spruta fäst med ett 0,22 μm filter så många gånger som behövs25.
OBS: Cirka 150 ml lockes lösning behövs vanligtvis för att tvätta 3 körtlar. - För matsmältning, injicera enzymlösningen genom binjurevenen med en 30 ml spruta fäst med ett 0,22 μm filter tills körteln börjar svälla. Lämna sedan körtlarna vid 37 °C i 10 minuter. Injicera igen och låt körtlarna stå vid 37 °C i ytterligare 10 minuter.
OBS: Cirka 30 ml enzymlösning behövs för att smälta 3 körtlar. - Efter matsmältningen, skär körteln i längdriktningen från venen till den andra änden med sax för att fälla ut körteln (figur 1C). Isolera medullae genom att pincett ut den vita medullan till en 10 cm petriskål som innehåller Lockes lösning.
OBS: Jämförelsen av körtelns inre före och efter matsmältningen visas i figur 1C. Detaljerna om matsmältningen och medullaeisoleringen rapporteras tidigare 23,25. - Skär och hacka medulla i små bitar med sax (figur 1D). Filtrera medulla suspensionen med ett 80-100 μm nylonnät i en bägare. Överför sedan filtratet till ett 50 ml koniskt rör för centrifugering vid 48 × g, rumstemperatur, i 3 minuter med retardation på 3.
OBS: Mincingen av medullae tar vanligtvis ~ 10 min. För att få ett bra utbyte av celler måste de malet bitarna vara mycket små tills de inte kan pincettas upp. - Efter centrifugering, ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten med Lockes lösning genom pipettering. Filtrera cellsuspensionen med en 80-100 μm sil och centrifugera vid 48 x g, rumstemperatur, i 3 min med retardation på 3.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 30 ml odlingsmedium (tabell 1). Bestäm cellnumret med hjälp av hemacytometerräkningskammare25.
2. Transfektion med elektroporering
- Överför 2,8 × 106 celler till ett 15 ml rör. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 48 × g i 2 min med retardation av 3. Tillsätt 100 μL transfektionsbuffert (se materialtabellen) som tillhandahålls av tillverkaren till cellpelleten och tillsätt sedan 2 μg ph-mNG-plasmiden.
OBS: PH-mNG-plasmiden skapades genom att ersätta det förbättrade gröna fluorescerande proteinet (EGFP) med mNG i PH-EGFP15 (se materialtabellen). - Blanda försiktigt suspensionen genom att pipettera lösningen uppåt och nedåt och överför blandningen till en elektroporeringskuvett utan dröjsmål (figur 1E). Överför omedelbart kyvetten till elektroinditorn (se materialförteckningen), välj O-005-programmet i skärmlistan och tryck på Enter för att utföra elektroporering.
OBS: Förbered cellsuspensionen för transfektion i en cellodlingshuv. För inte in luftbubblor i suspensionen under blandningssteget. Fortsätt till nästa steg utan dröjsmål. - Efter elektroporering tillsätt 1,8 ml medium omedelbart till kyvetten och blanda försiktigt med en mikropipettor utrustad med en steril spets. Tillsätt sedan 300 μL av suspensionen av de elektroporerade cellerna ovanpå täckglaset (se materialtabellen) i varje skål, plätering av totalt 5-6 rätter för en elektroporeringsreaktion.
- Överför försiktigt diskarna till en fuktad inkubator vid 37 °C med 9 % CO2 i 30 minuter och tillsätt försiktigt 2 ml förvärmt medium till varje skål efter 30 minuter.
- Förvara de transfekterade cellerna i den fuktade inkubatorn vid 37 °C med 9 %CO2 i 2–3 dagar före experimentet.
OBS: De odlade cellerna kommer att pågå i en vecka. Det är bäst att använda odlade celler på dag 2-3.
3. Förberedelse för inspelning av patchklämma och konfokal avbildning
OBS: Detta protokoll utfördes med ett laserscanningskonfokalmikroskop och patch-clamp-förstärkare med spänningskläminspelning tillsammans med en inlåsningsförstärkare för kapacitansinspelning. En XY-plankonfokal avbildning vid ett fast Z-plan (XY / Zfast skanning) användes för att avbilda alla tre fluorescerande signaler samtidigt. Z-planet var fokuserat på cellbotten där plasmamembranet fästes vid täckglasen.
- På dagen för patch-clamp och imaging experiment, observera cellerna under ett fluorescensmikroskop. Använd brightfield för att se till att cellodlingen inte är förorenad (figur 1F) och epifluorescens för att kontrollera om det fluorescerande taggade proteinet uttrycks korrekt.
OBS: Till exempel uttrycks PH-mNG vid plasmamembranet på ~ 20-30% av cellerna. - Förbered patchpipetter från borosilikatglaskapillärer. För att göra detta, dra pipetterna med en pipettdragare, täck spetsarna med flytande vax och polera dem med en mikroforge (se materialförteckningen).
- Slå på inspelningsförstärkaren för patchklämman och starta inspelningsprogramvaran för patchklämma (se materialtabellen). Ställ in lämpliga parametrar för kalciumström och kapacitansinspelning i programvaran (se materialtabellen).
- Ställ in ett inspelningsprotokoll på totalt 60 s varaktighet, där stimuleringen börjar vid 10 s.
- Ställ in hållpotentialen för inspelning av spänningsklämma till -80 mV. Ställ in en 1 s depolarisering från -80 mV till 10 mV som stimulans för att inducera kalciuminflöde och kapacitanshopp.
- För kapacitansmätningar, ställ in frekvensen för sinusformad stimulans till ett intervall på 1 000-1 500 Hz med en topp-till-toppspänning på högst 50 mV.
- Spara protokollet och skapa en ny fil för inspelning.
- Slå på konfokalmikroskopsystemet och ställ in lämpliga parametrar i programvaran (se materialtabellen).
- Slå på lasrarna, inklusive 458 nm, 514 nm och 633 nm, och ställ in emissionsuppsamlingsområdet för varje laser enligt varje fluorescenssond enligt följande. FFN511: excitationsvåglängd (EX), 458 nm; emissionsvåglängd (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Använd sekventiell avbildning för FFN511 och mNG för att undvika överhörning mellan dessa två sonder. Ställ in en timelapse på 1 min varaktighet för bildinspelning (bild 1G).
4. Patch-clamp inspelning och konfokal avbildning
- Välj en maträtt med bra celltillstånd och korrekt uttryck och tillsätt 2 μL fluorescerande falsk neurotransmittor FFN511 (10 mM lager, 1: 1 000 arbetslösning) i mediet. Sätt tillbaka skålen i inkubatorn i 20 min. Alternativt kan du ladda FFN511 efter steg 3.2 och utföra steg 3.3-3.5 medan du väntar på att spara tid.
- När FFN511-laddningen är klar, förbered inspelningskammaren och tillsätt 2 μL fluorescerande färgämne A655 till 500 μL av badlösningen (figur 2A och tabell 1). Överför täckglaset från skålen till inspelningskammaren (se materialtabellen) med pincett och tillsätt omedelbart en badlösning som innehåller A655 (figur 2B).
OBS: A655 förvaras i -20 °C med en koncentration på 10 mM och arbetskoncentrationen är 40 μM.
VARNING: Använd handskar för att undvika direkt hudkontakt med FFN511 eller A655. - Placera en droppe olja (brytningsindex: 1,518; se materialförteckningen) på 100x oljedykningsmålet (Numerisk bländare = 1,4). Montera kammaren i mikroskopet och använd justeringsknappen för att få oljan att bara komma i kontakt med botten av täckglaset och sänk sedan ner jordledningsspetsen i badlösningen (figur 2C, D).
OBS: Välj en nedsänkningsolja som är lämplig för arbete vid rumstemperatur. Att växla mellan låg- och högförstoringslinsen är onödigt. Rumstemperaturen hålls runt 20-22 °C under inspelningen. - Sätt cellerna i fokus och använd ljusfält och konfokal avbildning för att hitta en bra cell med mNG-uttryck. Zooma in på den markerade cellen och justera den till mitten av vyn för att minimera tomma områden.
OBS: Den schematiska ritningen av fluorescensmärkning visas i figur 3A. En bra cell har vanligtvis ett slätt membran och ren kant (figur 3B). Med epifluorescens eller konfokal avbildning verkar en bra cell ha en stor och platt botten med ljust mNG-uttryck (figur 3C).
Pixelstorleken är ~ 50 nm, inom ett intervall på ~ 40-80 nm beroende på olika cellstorlek och zoomfaktor. - Ställ in parametrar för XY-plankonfokal avbildning vid ett fast Z-plan (XY/Zfast skanning) av FFN511, PH-mNG och A655, med ett minimerat tidsintervall. Justera fokus till cellens botten med finjusteringsknappen.
OBS: PH-mNG signalerar konturen av cellplasmamembranet vid den konfokala XY-plankorssektionen (utom cellbotten). Nära cellmembranets botten kan A655-fläckar observeras, vilka återspeglar Ω eller Λ-formade membraninvaginationer. Om Z-fokalplanet är lägre än cellbotten blir intensiteten hos all fluorescens svagare. - Justera excitationslasereffekten i programvaran för att hitta en inställning för att få det bästa signal-brusförhållandet och undvika betydande fluorescensblekning. För att göra det, börja med ett initialt testvärde på 2,5 mW effekt för FFN511 exciterad vid 458 nm och 1 mW för mNG exciterad vid 514 nm. För A655 upphetsad vid 633 nm med en HeNe-laser, använd hög lasereffekt, ~ 12-15 mW (dvs. 70% -80% av det maximala), som vid kontinuerlig excitation kan bleka alla fluorescerande A655 inuti en Ω formprofil när dess por är stängd.
OBS: Om lasereffekten är för hög kommer PH-mNG och FFN511 fluorescens att blekas snabbt. Om lasereffekten är för låg blir signalerna för svaga eller bullriga för att kunna analyseras. - Tillsätt 9 μL intern lösning (tabell 1) i en lapppipett och fäst pipetten på hållaren i lappklämmans förstärkarsteg (se materialtabellen).
- Applicera en liten mängd positivt tryck med en spruta och flytta pipettspetsen för att röra badlösningen med en mikromanipulator. Se till att förstärkaren visar att pipettmotståndet är ~ 2-4 MΩ med ett spänningspulstest. Tryck på LJ/Auto för att avbryta vätskekorsningen.
- Flytta pipetten mot den valda cellen med mikromanipulatorn. För att bilda ett cellmonterat läge, flytta pipettspetsen för att röra vid cellen (motståndet ökar); applicera undertryck försiktigt med sprutan (motståndet ökar till mer än 1 GΩ), ändra hållpotentialen från 0 till -80 mV.
- När motståndet passerar 1 GΩ, vänta i ~ 30 s tills konfigurationen stabiliseras. Tryck på C-fast/Auto för att kompensera för snabb kapacitans.
- För att bilda ett helcellsläge, applicera pulserat kort men ändå kraftfullt undertryck med sprutan för att bryta membranet (formen på den aktuella pulsen ändras med en laddad och urladdad membrankondensator). Tryck på C-slow/Auto för att kompensera för långsam kapacitans.
- Justera bildfokus något för att fokusera på cellens botten. Starta konfokal timelapse-avbildning och patch-clamp-inspelning samtidigt genom att klicka på Start-knapparna i de två olika programmen samtidigt.
OBS: Den konfokala bildprogramvaran gör en film med en hastighet av ~ 20-90 ms / bildruta. Patch-clamp-inspelningen inkluderar vilotillståndet i 10 s, 1 s depolariseringsstimulering och ytterligare 49 s efter stimulering. Patch-clamp-konfigurationen möjliggör inspelning av kalciumström, kapacitanshopp och sönderfall inducerat av 1 s-depolariseringen från -80 till +10 mV (figur 3D). - När inspelningen är klar, se till att data sparas. Ändra hållpotentialen tillbaka till 0 mV. Flytta pipetten ur badlösningen och kassera den.
- Upprepa steg 4.7-4.13 för att spela in en annan cell i skålen. Efter 1 timmes inspelning, byt till en annan maträtt för inspelning.
OBS: Efter 1 timmes inspelning minskar framgångsgraden för patch-clamp-inspelning avsevärt. För att öka effektiviteten i datainsamlingen rekommenderas inspelning i endast 1 timme i varje maträtt.
5. Patch-clamp dataanalys
- Öppna lämplig programvara (se materialförteckningen) för dataanalys. Klicka på PPT-| Ladda PULSE-fil | Filknappar för att ladda .dat-filen. Klicka på Gör det så ritas fyra spår automatiskt i ett diagram inklusive kalciumström och kapacitansspår.
- Klicka på Windows-| Nya diagramknappar , välj Pulse_1_1_1, den första vågen i Y-våg (er) och klicka på Gör det för att rita kalciumströmdiagrammet. Klicka på Windows-| Nya tabellknappar , välj Pulse_1_1_1 och klicka på Gör det för att visa rådata för kalciumström, som kan användas för att plotta det genomsnittliga spåret av flera celler.
- Rita en fyrkant i enlighet med detta i kalciumströmdiagrammet, högerklicka och expandera den aktuella signalen för att inkludera baslinjen och toppen av kalciumströmmen. Klicka på Diagram | Visa Info för att visa markörerna A och B och flytta dem till baslinjen respektive toppen. Grafinformationen visas längst ner och parametrar kan uppskattas.
- Upprepa steg 5.2, men välj Pulse_1_1_1_Cm, den andra vågen i Y-våg(ar), för att plotta kapacitansspåret. Upprepa steg 5.3 och placera A- och B-markörerna i lämplig position för att mäta kapacitansparametrarna, till exempel baslinje, amplitud och sönderfallshastighet.
- Kopiera rådata i steg 5.2 till ett kalkylblad, beräkna medelvärdet och standardfelet för medelvärdet för en grupp registrerade celler och plotta de genomsnittliga spåren av kalciumström och membrankapacitans (figur 3E) i en lämplig programvara.
6. Analys av konfokala bilddata
- Öppna de råa bildfilerna med valfri programvara från tillverkaren (se materialförteckningen).
OBS: Vissa andra fria program, som ImageJ eller Fiji, kan användas för databehandling och kvantifiering av bilderna som erhållits i avsnitt 4. - Klicka på Bearbeta | ProcessTools och använd verktygen för att generera rullande medelvärde (t.ex. rullande medelvärde för varje 4 bilder) filer för varje timelapse-bild och spara dessa filer.
OBS: Efter rullande medelvärde kan lämplig justering av ljusstyrka och bakgrund göras för att visa fluorescensförändringarna i tre kanaler bättre, vilket kan hjälpa till att identifiera fusionshändelser. Kontrollera den fluorescerande intensiteten i vissa regioner utan fusionshändelse kan hjälpa till att skilja den fluorescerande signalen för fusionshändelser från bakgrundssignaler. - Klicka på knapparna Kvantifiera | Verktyg | Stack Profil, kontrollera tidpunkter före och efter stimulering för att identifiera fluorescensförändringar i varje kanal. Klicka på ellipsknappen Rita för att ringa in intressanta regioner (ROI) för fusionshändelser. Högerklicka på bilden och klicka på Spara AVKASTNING för att spara AVKASTNING: erna.
OBS: Storleken på ROI, som täcker alla de tre fluorescerande signalerna, var liknande med vesikelstorlek i kromaffinceller24. Rådata användes för analysen, medan rullande medelvärdesdata som ökar signal-brusförhållandet tillhandahölls för att tydligt visa de tre signalerna. - Klick Öppna projekt för att hitta råfilen, högerklicka på bilden och klicka på Ladda ROI för att ladda ROI-filen i de råa bildfilerna för att mäta fluorescensintensiteterna.
OBS: Den råa fluorescerande signalen kommer att användas för att plotta spår av olika kanaler. För varje ROI definieras baslinjen som intensiteten före stimulering och intensitetsspårningarna kan normaliseras till baslinjen. - Klicka på Verktyg | Sortera AVKASTNING i programvaran och rita spåren för alla tre kanalerna för varje ROI. Klicka på Rapportera för att spara ROI-data, inklusive både digitala data och bildspårningar för varje ROI, i en filmapp.
- Identifiera en fusionshändelse genom samtidig ökning av intensiteten av PH-mNG (FPH) och A655 (F655) fläckfluorescens (inom en enda ram), åtföljd av en minskning av FFN511 spotfluorescens (FFFN).
- Leta efter utseendet på FPH och F655, vilket indikerar PH-mNG / A655-fläckbildning på grund av en Ω-profil genererad genom fusion, vilket möjliggör diffusion av PH-mNG från plasmamembranet och ihållande diffusion av A655 från badet.
- Leta efter FFFN-minskning , vilket indikerar dess frisättning från en vesikel på grund av fusionsporöppning och utesluter möjligheten att FPH och F655-utseende kan vara från membraninvagination orsakad av endocytos.
- Inspektera defasta timelapse XY/Z-bilderna som visar fusionshändelser som händer på cellens botten. Analysera tre lägen för fusionshändelser: 1) nära fusion, 2) stay-fusion och 3) shrink-fusion.
OBS: Fusionshändelser observerades sällan före depolarisering, medan tiotals fusionshändelser kunde observeras efter depolarisering. Efter fusion kan Ω-profilen stänga sin por, behålla sin öppna por eller krympa för att smälta samman i plasmamembranet.- För att identifiera nära fusion, leta efter dimning av F655 eftersom fusionsporstängning förhindrar utbyte av bad A655, medan FPH upprätthålls, vilket återspeglar den fortsatta omvandlingen av PtdIns (4,5) P2 till PtdIns (4) P, eller FPH sönderfaller med en fördröjning, vilket återspeglar vesikelavkoppling (nära fusion, figur 4A, B).
- Leta efter ihållande FPH och F655 för att identifiera stay-fusion (figur 4C).
- Leta efter parallella minskningar av FPH och F655, vilket indikerar Ω-profilkrympning för att identifiera krympfusion (figur 4D).
OBS: Kontrollera de ursprungliga bildfilerna för att inspektera bildspåren om det är osäkert om händelsetypen är osäker. Kontroll av den fluorescerande intensiteten i vissa regioner utan fusionshändelse kan hjälpa till att skilja den fluorescerande signalen för fusionshändelser från bakgrundssignaler.
- Rita representativa spår av intensitetsförändringar för dessa tre kanaler: FFN511, PH-mNG och A655. Kvantifiera procentandelen av olika fusionslägen i varje cell och rita upp siffror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de experimentella procedurer som visas i figur 1 och figur 2 transfekterades kromaffinceller från nötkreaturs binjurar med PH-mNG för att märka plasmamembranet; A655 tillsattes till badlösningen för att detektera fusionsporförslutning; och fluorescerande falsk neurotransmittor FFN511 laddades i vesiklar för detektion av frisättning. Därefter utfördes XY-plan konfokal timelapse-avbildning av FFN511, PH-mNG och A655 var 20-90 ms vid cellbotten (Z-fokalplan ~ 100-200 nm ovanför cellmembranet). Inspelning av helcellsplåster och applicering av en 1 s depolarisering från -80 till +10 mV utfördes för att framkalla exo- och endocytos (figur 3A-C). Denna depolarisering inducerade en inre kalciumström, ett kapacitanshopp som indikerar exocytos och ett kapacitansförfall efter hoppet som indikerar endocytos (Figur 3D, E).
Med timelapse XY/Zfast avbildning i cellbotten observerades många individuella fusionshändelser 8,24 efter depolarisering (figur 4A), medan sällsynta fusionshändelser observerades före depolarisering. Fusionshändelser inducerade av 1 s depolariseringsprotokoll identifierades som FFN511 spotfluorescens (FFFN) minskning som återspeglar FFN511-frisättning, åtföljd av FPH och A655 spotfluorescens (F655) ökning som återspeglar PH-mNG och A655 diffusion från plasmamembranet och badlösningen in i smältningsvesikeln (den fusionsgenererade Ω-profilen)15.
Efter fusion kan Ω-profilen som genereras av vesikelfusion med plasmamembranet 1) stänga sin por, kallad nära fusion, 2) upprätthålla en öppen fusionspor, kallad stay-fusion, eller 3) krympa för att smälta samman i plasmamembranet, kallad krympfusion. Nära fusion identifierades som F655-dimning medan FPH upprätthölls eller förföll med en fördröjning (figur 4B). Stay-fusion detekterades som den ihållande närvaron av både PH-mNG- och A655-fläckar (figur 4C). Krympfusion detekterades som parallellt FPH- och F655-sönderfall åtföljt av en parallell storleksreduktion av PH-mNG-platsen och A655-spoten (figur 4D)8,15,16,24.
(A, B) Bovina binjurar trimmas med sax för att avlägsna fettvävnad (A), spolas med Lockes lösning och smälts genom binjurvenen (B). (C) Det inre av en binjure utan matsmältning (vänster) eller efter korrekt matsmältning (höger). (D) Efter att ha tvättats och smälts isoleras medullae och malets i små bitar, och kromaffinceller separeras från malet medullae efter filtrering och centrifugering. (E) Kromaffinceller elektroporeras och pläteras på täckglas för inkubation. (F) På dag 2-3, kontrollera kromaffincellerna under ett mikroskop före experiment. (G) Cellprovet är inbäddat i kammaren för inspelning av lappklämma och konfokal avbildning. Kalciumström och kapacitansförändringar registreras, förstärks och visas på monitorn. Fluorescensförändringar vid stimulering detekteras och visas på monitorn. Skalstänger = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Patch-clamp och konfokal inställning (A) På experimentdagen inkuberas kromaffincellerna som odlas på täckglas med FFN511 i 20 minuter. Färgämnet A655 tillsätts till badlösningen. (B) Kromaffinceller på täckglaset överförs till en inspelningskammare och badlösningen med A655 tillsätts till kammaren. (C) Efter tillsats av en droppe olja på 100x oljedjupningsmålet monteras kammaren på scenen i ett inverterat konfokalmikroskop. Jordtrådens spets är nedsänkt i badlösning. Pipetten sätts på plats efter lastning med pipettlösning och hålls av en pipetthållare, som är fäst vid en huvudtage. Huvudsteget styrs av en motoriserad mikromanipulator. (D) Efter att ha hittat en bra cell, flytta pipettspetsen till badlösningen med mikromanipulatorn för att starta inspelning av helcellsplåster och konfokal avbildning. Skalstänger = 10 mm (A), 5 mm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Helcellsspänningskläminspelningar av kalciumströmmar och kapacitansförändringar inducerade av depolarisering. Kromaffincellen är nedsänkt i A655-innehållande badlösning (röd), och cellmembranet och vesiklarna är märkta med PH-mNG (grön) respektive FFN511 (cyan). Den här bilden har ändrats med tillstånd från 24. (B) En representativ bild av en lappklämd kromaffincell observerad av brightfield. (C) Representativa bilder av PH-mNG (grön), A655 (röd) och FFN511 (cyan) i en cell med bra fokus på cellavtrycket. (D) Ett exempel på kalciumström och kapacitansförändringar inducerade av 1 s depolarisering från -80 till +10 mV. (E) De genomsnittliga spåren av kalciumströmmar (ICa) och kapacitans (Cm) förändras uppsamlade från 20 kromaffinceller. Den här bilden har ändrats med tillstånd från 26. Skalstänger = 5 μm (B, C). Förkortningar: ICa = kalciumström; Cm = kapacitans; Depol = depolarisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Visualisering av fusionshändelser under konfokalmikroskopet.(A) Många fusionsfläckar kan detekteras med konfokal XY-planavbildning av PH-mNG (grön), A655 (röd) och FFN511 (cyan) längst ner i cellen. Fusion framkallades av en 1 s depolarisering från -80 till +10 mV (depol1s). FFN-fläckar genomgick frisättning och nära fusion (cirklar). Bilder före (-1 s) och efter (+1 s och +10 s) depolarisering visas. (B) Ett exempel på nära fusion. (C) Ett exempel på stay-fusion. (D) Ett exempel på krympfusion. Den här bilden har ändrats med tillstånd från 24. Skalstänger = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Förkortningar: Depol = depolarisering; F = fluorescerande intensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Medium/Lösning | Beskrivning | ||
| Lockes lösning | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM glukos och 10 mM HEPES, pH 7,3, justerat med NaOH | ||
| Enzymlösning | 1,5 mg/ml kollagenas P, 0,325 mg/ml trypsinhämmare och 5 mg/ml bovint serumalbumin i Lockes lösning | ||
| Kultur medium | DMEM-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum | ||
| Intern lösning | 130 mM Cs-glutamat, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP och 0,5 mM GTP, pH 7,2, justerat med CsOH | ||
| Bad lösning | 125 mM NaCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl och 20 mM TEA, pH 7,3, justerat med NaOH | ||
Tabell 1: Detaljer om sammansättningen av odlingsmedium och lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En konfokal mikroskopisk avbildningsmetod beskrivs för att detektera dynamiken i fusionspor- och transmitterfrisättning, samt tre fusionslägen, nära fusion, stay-fusion och krympfusion i bovina binjurekromaffinceller 4,24. En elektrofysiologisk metod för att depolarisera cellen och därigenom framkalla exo- och endocytos beskrivs. Systematisk konfokal bildbehandling ger information om olika lägen för porbeteenden för fusions- och fissionshändelser.
Samtidig övervakning av kalciumström och kapacitansförändringar vid samma cell med helcellskonfigurationen ger ytterligare information om exo- och endocytos, vilket innebär förhållandet mellan poröppning och stängning på helcellsnivå vid varje given tidpunkt. Dessa metoder är i princip tillämpliga på andra exciterbara celler och icke-elektriskt exciterbara celler i primärkultur eller i cellinjer som innehåller vesiklar på ~ 200-1 600 nm15. Förutom kromaffinceller har metoden som beskrivs här tillämpats på en beta-cellinje för råtta, INS-1-celler4.
I princip kan metoden också tillämpas på sekretoriska celler innehållande vesiklar mindre än 200 nm. Men eftersom vesikelstorleken minskar kan signal-brusförhållandet vara för lågt för tillförlitlig detektering. Superupplösningsavbildning istället för konfokal avbildning kan bli nödvändig. Hittills har de metoder som beskrivs här inte tillämpats på synapser som innehåller ~ 40 nm synaptiska vesiklar.
Framgångsrik implementering av metoden som beskrivs här beror kritiskt på flera allmänna steg, såsom odlingscellkvalitet, plasmidtransfektionseffektivitet och elektrofysiologisk inspelningsframgångsgrad. För det första är friska celler avgörande för både patch-clamp-inspelning och konfokal avbildning. Det rekommenderas inte att använda antibakteriella eller antifungala medel under odling eftersom dessa kemikalier kan påverka excitabiliteten hos kromaffinceller. Således är flitig övning av steril teknik och användning av nyberedda medier viktiga. Även om primära odlingskromaffinceller kan överleva i rätter i minst en vecka25, är det viktigt för nya användare att använda celler på dag 2 till 3 för experimenten. När fibroblaster växer gradvis blir det svårare att fastställa konfigurationen för helcellsplåster. För det andra är elektroporeringseffektiviteten hos plasmider i kromaffinceller ungefär 20-30%. Elektroporeringseffektiviteten måste optimeras om den är för låg eller PH-mNG-fluorescensen är för svag. För det tredje avbildades celler i botten med ett 100x oljemål för att erhålla väsentliga händelser som indikeras av förändringar i tre fluorescerande sonder: FFN511, PH-mNG och A655. Även om DIC ger en tydligare bild än ljusfält eller avbildning med blotta ögat när man upprättar hela cellkonfigurationen, är alla visualiseringstekniker som gör det möjligt för användaren att upprätta konfigurationen tillräckliga.
Lämplig laserstyrka är avgörande för konfokal avbildning i levande celler. Eftersom FFN511 och mNG kan blekas av hög lasereffekt är det bättre att leta efter en bra cell med epifluorescens före visualisering med konfokallasrar. För A655 behövs laserexcitation med hög effekt för att bleka färgämnet inuti vesiklarna. Dessutom är den vanligaste orsaken till att detta experiment misslyckas ett fel på patch-clamp-inspelning. En ren och polerad pipettspets av rätt storlek och övning som genererar hela cellkonfigurationen på kromaffinceller är nyckelfaktorer. Även om det kan ta lite tid och ansträngning att lyckas, när de väl är etablerade, ger dessa experiment betydande data om både fusions- och fissionshändelser, vilket indikerar membranporöppning och stängning på en enda händelsenivå.
Protokollet som beskrivs här kan användas med vissa modifieringar för att ytterligare olika experimentella mål. Oavsett experimentella mål är det dock lämpligt att först använda högkaliumlösning (såsom 70 mM KCl) som stimulans för att se de förändringar som membranet genomgår vid depolarisering, vilket säkerställer att intensitetsförändringarna i dessa tre färgämnen, FFN, PH och A655, kan visualiseras. Plasmamembranet kan märkas med andra membranbindande fluoroforer, såsom mCLING (membranbindande fluorofor-cystein-lysin-palmitoylgrupp)4,27 eller CAAX (ett proteinmotiv som riktar sig mot cytosolfasat plasmamembran via cysteinrester isoprenylation)4,28. A655 kan ersättas med andra färgämnen med olika spektra, såsom Atto 532 (A532), beroende på kombinationen av fluorescerande molekyler som används i vissa experiment15. Neuropeptid Y kan användas istället för fluorescerande falska neurotransmittorer16.
FFN511 exciterades vid 458 nm istället för 405 nm i detta experiment trots att toppexcitationsspektrumet för FFN511 är cirka 405 nm. Studie med kapacitansregistrering visade ingen signifikant skillnad i kromaffinceller med eller utan PH-mNG, vilket indikerar att överuttryck av PH-mNG inte påverkar exocytos och endocytos15,24. Liknande procentsatser för fusionshändelser verifierades i kromaffinceller märkta med endast PH-mNG och A532 eller med FFN511, vilket visar att laddning av FFN511 i kromaffinblåsor inte påverkar innehållsfrisättningen och olika fusionslägen16. 1 s depolariseringsstimulering kan ersättas med hög kaliumlösning eller andra depolariseringar. Dessa modifieringar kan användas för att anpassa sig till olika experimentella mål.
Trots fördelarna med denna kraftfulla metod har den vissa begränsningar. Den största begränsningen är relaterad till den diffraktionsbegränsade upplösningen (~ 230 nm) för konfokalmikroskopi, som kan övervinnas med mer avancerade superupplösningsmikroskopitekniker29. Granulatdiametern i bovina kromaffinceller är ~ 300 nm6, vilket gör det möjligt att observera membranporöppning och stängning inom den rumsliga upplösningen av konfokalmikroskopi. Synaptiska vesiklar är dock ~ 30-60 nm30, vilket är bortom konfokal upplösning. Att utvidga dessa levande cellavbildningsmätningar till små synaptiska vesiklar visar sig vara svårt med konfokal avbildning.
Levande cellavbildningstekniker med bättre temporal och / eller rumslig upplösning, såsom STED-mikroskopi, stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM), total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi och minimal fotonflöden (MINFLUX) nanoscopy har utvecklats och kan tillämpas på denna metod 31,32,33,34 . Faktum är att STED-mikroskopi har använts för att avslöja fusionspordynamik i kromaffinceller. De olika sätten för fusionshändelser och förformade Ω-profilstängning kan verifieras ytterligare med hjälp av superupplösningsmikroskopi såsom STED-mikroskopi24. Andra begränsningar inkluderar fotoblekning och cytotoxicitet hos fluorescerande proteiner och färgämnen.
Denna kombination av elektrofysiologi och konfokalmikroskopi kan tillämpas i stor utsträckning på många sekretoriska celler. Kombinationen av superupplösningsmikroskopi med de metoder som beskrivs här skulle vara ett värdefullt verktyg för att mäta fusionspordynamik i neurala kretsar i framtiden, förutsatt att superupplösningsmikroskopi kommer att utvecklas i en sådan utsträckning att den kan lösa fusionsporen vid nervterminaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 och ZIA NS003105-08) för att stödja detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C.
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al.
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O'Connor, D. T., et al.
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al.
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
