Summary
Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.
Abstract
L’ouverture et la fermeture dynamiques des pores de fusion médient l’exocytose et l’endocytose et déterminent leur cinétique. Ici, il est démontré en détail comment la microscopie confocale a été utilisée en combinaison avec l’enregistrement patch-clamp pour détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines en culture primaire. Les trois modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant le retrait du profil en forme de Ω généré par la fusion jusqu’à ce qu’il fusionne complètement au niveau de la membrane plasmique.
Pour détecter ces modes de fusion, la membrane plasmique a été marquée en surexprimant mNeonGreen attaché au domaine PH de la phospholipase C δ (PH-mNG), qui se lie au phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) au niveau de la feuillet face au cytosol de la membrane plasmique; les vésicules ont été chargées avec le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 pour détecter la libération de contenu vésiculeux; et Atto 655 a été inclus dans la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion. Ces trois sondes fluorescentes ont été imagées simultanément à environ 20-90 ms par image dans des cellules chromaffines vivantes pour détecter l’ouverture des pores de fusion, la libération de contenu, la fermeture des pores de fusion et les changements de taille des vésicules de fusion. La méthode d’analyse est décrite pour distinguer trois modes de fusion de ces mesures de fluorescence. La méthode décrite ici peut, en principe, s’appliquer à de nombreuses cellules sécrétoires au-delà des cellules chromaffines.
Introduction
La fusion membranaire médie de nombreuses fonctions biologiques, y compris la transmission synaptique, l’homéostasie de la glycémie, la réponse immunitaire et l’entrée virale 1,2,3. L’exocytose, impliquant la fusion des vésicules au niveau de la membrane plasmique, libère des neurotransmetteurs et des hormones pour atteindre de nombreuses fonctions importantes, telles que les activités du réseau neuronal. La fusion ouvre un pore pour libérer le contenu vésiculeux, après quoi le pore peut se fermer pour récupérer la vésicule de fusion, appelée baiser et courir 1,4. L’ouverture irréversible et réversible des pores de fusion peut être mesurée avec des enregistrements de capacité attachés à des cellules combinés à des enregistrements de conductance des pores de fusion de fusion de vésicules uniques.
Ceci est souvent interprété comme reflétant la fusion d’effondrement complet, impliquant la dilatation de la fusion jusqu’à l’aplatissement de la vésicule de fusion, et le baiser et le run, impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, respectivement 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Des études récentes d’imagerie par épuisement des émissions confocales et stimulées (STED) dans des cellules chromaffines ont directement observé l’ouverture et la fermeture des pores de fusion (kiss-and-run, également appelée fusion fermée), l’ouverture des pores de fusion qui maintient une forme de Ω avec un pore ouvert pendant une longue période, appelée stay-fusion, et le rétrécissement de la vésicule de fusion jusqu’à ce qu’elle fusionne complètement avec la membrane plasmique, ce qui remplace la fusion à effondrement complet pour fusionner les vésicules de fusion avec la membrane plasmique4, 8,14,15,16,17.
Dans les neurones, l’ouverture et la fermeture des pores de fusion ont été détectées par imagerie montrant la libération de points quantiques préchargés dans des vésicules plus grandes que le pore de fusion et avec des mesures de conductance des pores de fusion à la face de libération des terminaisons nerveuses 5,18,19. Les cellules chromaffines surrénales sont largement utilisées comme modèle pour l’étude de l’exo- et de l’endocytose20,21. Bien que les cellules chromaffines contiennent de grandes vésicules à noyau dense, tandis que les synapses contiennent de petites vésicules synaptiques, les protéines d’exocytose et d’endocytose dans les cellules chromaffines et les synapses sont assez analogues 10,11,12,20,21,22,23.
Ici, une méthode est décrite pour mesurer ces trois modes de fusion à l’aide d’une méthode d’imagerie confocale combinée à l’électrophysiologie dans les cellules chromaffines surrénales bovines (Figure 1). Cette méthode consiste à charger de faux neurotransmetteurs fluorescents (FFN511) dans des vésicules pour détecter l’exocytose; ajout d’Atto 655 (A655) dans la solution de bain pour remplir le profil en forme de Ω généré par fusion, et marquage de la membrane plasmique avec le domaine PH de la phospholipase C δ (PH), qui se lie à PtdIns(4,5)P2 à la membrane plasmique 8,15,24. La dynamique des pores de fusion peut être détectée par des changements dans différentes intensités fluorescentes. Bien que décrit pour les cellules chromaffines, le principe de cette méthode décrit ici peut être largement appliqué à de nombreuses cellules sécrétoires bien au-delà des cellules chromaffines.
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Protocol
REMARQUE: La procédure d’utilisation des animaux a suivi les directives des NIH et a été approuvée par le nih Animal Care and Use Committee.
1. Culture de cellules chromaffines bovines
- Préparer la solution de Locke (Tableau 1) et les outils d’autoclave 1 jour avant la culture de cellules chromaffines.
- Obtenez des glandes surrénales bovines d’un abattoir local le jour de la culture et gardez-les immergées dans la solution glacée de Locke avant la dissection.
REMARQUE: Les glandes surrénales sont de 21 à 27 mois, en bonne santé, Angus noir de l’un ou l’autre sexe (principalement masculin) avec un poids corporel d’environ 1 400 livres (~ 635 kg). - Préparer 30 mL (pour 3 glandes surrénales) de solution enzymatique fraîche contenant de la collagénase P, un inhibiteur de la trypsine et de l’albumine sérique bovine (tableau 1) avant la dissection et la maintenir à température ambiante.
- Choisissez 3 glandes intactes sans coupures ni saignements à la surface et retirez le tissu adipeux avec des ciseaux (Figure 1A). Lavez les glandes par perfusion avec la solution de Locke jusqu’à ce qu’aucun sang ne sorte. Pour ce faire, gonflez la glande à travers la veine surrénale (Figure 1B) à l’aide d’une seringue de 30 mL attachée avec un filtre de 0,22 μm autant de fois que nécessaire25.
REMARQUE: Environ 150 mL de solution de Locke sont généralement nécessaires pour laver 3 glandes. - Pour la digestion, injecter la solution enzymatique à travers la veine surrénale à l’aide d’une seringue de 30 mL attachée avec un filtre de 0,22 μm jusqu’à ce que la glande commence à gonfler. Ensuite, laissez les glandes à 37 °C pendant 10 min. Injecter à nouveau et laisser les glandes à 37 °C pendant encore 10 min.
REMARQUE: Environ 30 mL de solution enzymatique sont nécessaires pour digérer 3 glandes. - Après la digestion, coupez la glande longitudinalement de la veine à l’autre extrémité avec des ciseaux pour déplier la glande (Figure 1C). Isolez les médules en pinçant la médulla blanche dans une boîte de Petri de 10 cm contenant la solution de Locke.
REMARQUE: La comparaison de l’intérieur de la glande avant et après la digestion est illustrée à la figure 1C. Les détails de la digestion et de l’isolement des moelles sont rapportés précédemment23,25. - Couper et hacher la médulla en petits morceaux avec des ciseaux (Figure 1D). Filtrer la suspension médullaire avec une maille de nylon de 80 à 100 μm dans un bécher. Transférer ensuite le filtrat dans un tube conique de 50 mL pour centrifugation à 48 × g, température ambiante, pendant 3 min avec décélération de 3.
REMARQUE: Le hachage des moelles prend généralement environ 10 minutes. Pour obtenir un bon rendement en cellules, les morceaux hachés doivent être très petits, jusqu’à ce qu’ils ne puissent pas être pincés. - Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule avec la solution de Locke par pipetage. Filtrer la suspension de la cellule avec une passoire de 80-100 μm et centrifuger à 48 x g, température ambiante, pendant 3 min avec une décélération de 3.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 30 ml de milieu de culture (tableau 1). Déterminez le nombre de cellules à l’aide des chambres de comptage de l’hémacytomètre25.
2. Transfection par électroporation
- Transférer 2,8 × 106 cellules dans un tube de 15 mL. Granulés les cellules par centrifugation à 48 × g pendant 2 min avec décélération de 3. Ajouter 100 μL de tampon de transfection (voir le tableau des matériaux) fourni par le fabricant à la pastille de cellule, puis ajouter 2 μg du plasmide PH-mNG.
REMARQUE: Le plasmide PH-mNG a été créé en remplaçant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) par mNG dans PH-EGFP15 (voir le tableau des matériaux). - Mélanger doucement la suspension en pipetant la solution de haut en bas et transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation sans délai (Figure 1E). Transférez immédiatement la cuvette dans l’électroporateur (voir la table des matériaux), sélectionnez le programme O-005 dans la liste des écrans et appuyez sur Entrée pour effectuer l’électroporation.
REMARQUE: Préparer la suspension cellulaire pour la transfection dans une hotte de culture cellulaire. N’introduisez pas de bulles d’air dans la suspension pendant l’étape de mélange. Passez à l’étape suivante sans délai. - Après électroporation, ajouter immédiatement 1,8 mL de milieu à la cuvette et mélanger doucement avec un micropipeteur équipé d’une pointe stérile. Ajoutez ensuite 300 μL de la suspension des cellules électroporées sur le dessus du couvercle (voir le tableau des matériaux) dans chaque plat, en plaquant 5 à 6 plats au total pour une réaction d’électroporation.
- Transférer délicatement la vaisselle dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 9 % de CO2 pendant 30 min, et ajouter doucement 2 mL de milieu préaverti à chaque plat après 30 min.
- Conservez les cellules transfectées dans l’incubateur humidifié à 37 °C avec 9 % de CO2 pendant 2 à 3 jours avant l’expérience.
REMARQUE: Les cellules cultivées dureront une semaine. Il est préférable d’utiliser des cellules cultivées les jours 2-3.
3. Préparation pour l’enregistrement par patch-clamp et l’imagerie confocale
REMARQUE: Ce protocole a été réalisé avec un microscope confocal à balayage laser et un amplificateur patch-clamp avec enregistrement tension-pince ainsi qu’un amplificateur de verrouillage pour l’enregistrement de capacité. Une imagerie confocale du plan XY à un plan Z fixe (balayagefixe XY/Z) a été utilisée pour imager les trois signaux fluorescents simultanément. Le plan Z était focalisé au fond de la cellule où la membrane plasmique adhérait aux couvercles.
- Le jour de l’expérience de patch-clamp et d’imagerie, observez les cellules sous un microscope à fluorescence. Utilisez le champ lumineux pour vous assurer que la culture cellulaire n’est pas contaminée (Figure 1F) et l’épifluorescence pour vérifier la bonne expression de la protéine marquée par fluorescence.
REMARQUE: Par exemple, PH-mNG est exprimé à la membrane plasmique d’environ 20-30% des cellules. - Préparez des pipettes de patch à partir de capillaires en verre borosilicate. Pour ce faire, tirez les pipettes avec un extracteur de pipette, enduisez leurs pointes de cire liquide et polissez-les avec une microforge (voir le Tableau des matériaux).
- Allumez l’amplificateur d’enregistrement patch-clamp et démarrez le logiciel d’enregistrement patch-clamp (voir la Table des matériaux). Définissez les paramètres appropriés pour l’enregistrement du courant calcique et de la capacité dans le logiciel (voir le tableau des matériaux).
- Définissez un protocole d’enregistrement d’une durée totale de 60 s, où la stimulation commence à 10 s.
- Réglez le potentiel de maintien pour l’enregistrement de la pince de tension à -80 mV. Définissez une dépolarisation de 1 s de -80 mV à 10 mV comme stimulus pour induire l’afflux de calcium et le saut de capacité.
- Pour les mesures de capacité, réglez la fréquence du stimulus sinusoïdal sur une plage de 1 000 à 1 500 Hz avec une tension de crête à crête ne dépassant pas 50 mV.
- Enregistrez le protocole et créez un nouveau fichier pour l’enregistrement.
- Allumez le système de microscope confocal et définissez les paramètres appropriés dans le logiciel (voir le tableau des matériaux).
- Allumez les lasers, y compris 458 nm, 514 nm et 633 nm, et réglez la plage de collecte des émissions pour chaque laser en fonction de chaque sonde de fluorescence comme indiqué ci-dessous. FFN511: longueur d’onde d’excitation (EX), 458 nm; longueur d’onde d’émission (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655 : EX, 633 nm ; EM, 650-700 nm.
- Utilisez l’imagerie séquentielle pour FFN511 et mNG afin d’éviter la diaphonie entre ces deux sondes. Définissez un timelapse d’une durée de 1 min pour l’enregistrement de l’image (Figure 1G).
4. Enregistrement patch-clamp et imagerie confocale
- Choisissez un plat avec un bon état cellulaire et une expression correcte et ajoutez 2 μL de faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 (stock de 10 mM, solution de travail 1:1 000) dans le milieu. Remettez le plat dans l’incubateur pendant 20 min. Vous pouvez également charger FFN511 après l’étape 3.2 et effectuer les étapes 3.3 à 3.5 en attendant de gagner du temps.
- Une fois le chargement FFN511 terminé, préparer la chambre d’enregistrement et ajouter 2 μL de colorant fluorescent A655 dans 500 μL de la solution de bain (figure 2A et tableau 1). Transférer le couvercle de la parabole dans la chambre d’enregistrement (voir la table des matériaux) à l’aide d’une pince à épiler et ajouter immédiatement une solution de bain contenant de l’A655 (Figure 2B).
REMARQUE: L’A655 est maintenu à -20 °C avec une concentration de 10 mM et la concentration en service est de 40 μM.
ATTENTION : Portez des gants pour éviter tout contact cutané direct avec FFN511 ou A655. - Placer une goutte d’huile (indice de réfraction : 1,518 ; voir le Tableau des matériaux) sur l’objectif d’immersion dans l’huile 100x (Ouverture numérique = 1,4). Montez la chambre dans le microscope et utilisez le bouton de réglage pour que l’huile entre simplement en contact avec le bas du couvercle, puis immergez la pointe du fil de terre dans la solution de bain (Figure 2C, D).
REMARQUE: Choisissez une huile d’immersion appropriée pour travailler à température ambiante. Il n’est pas nécessaire de basculer entre l’objectif à faible et à fort grossissement. La température ambiante est maintenue autour de 20-22 °C pendant l’enregistrement. - Mettez les cellules au point et utilisez l’imagerie en champ clair et confocale pour trouver une bonne cellule avec une expression mNG. Effectuez un zoom avant sur la cellule sélectionnée et ajustez-la au centre de la vue pour réduire les zones vides.
REMARQUE : Le dessin schématique de l’étiquetage par fluorescence est illustré à la figure 3A. Une bonne cellule a généralement une membrane lisse et un bord propre (Figure 3B). Avec l’épifluorescence ou l’imagerie confocale, une bonne cellule semble avoir un fond grand et plat avec une expression lumineuse de mNG (Figure 3C).
La taille des pixels est d’environ 50 nm, dans une plage de ~40-80 nm en fonction de la taille de cellule et du facteur de zoom différents. - Configurez les paramètres de l’imagerie confocale du plan XY sur un plan Z fixe (balayagefixe XY/Z) de FFN511, PH-mNG et A655, avec un intervalle de temps réduit. Réglez la mise au point vers le bas de la cellule avec le bouton de réglage fin.
REMARQUE: PH-mNG signale le contour de la membrane plasmique cellulaire à la section confocale du plan XY (à l’exception du fond de la cellule). Près du fond de la membrane cellulaire, des taches A655 peuvent être observées, qui reflètent des invaginations membranaires en forme de Ω ou en forme de Λ. Si le plan focal Z est inférieur au fond de la cellule, l’intensité de toute fluorescence deviendra plus faible. - Ajustez la puissance du laser d’excitation dans le logiciel pour trouver un réglage permettant d’obtenir le meilleur rapport signal/bruit et d’éviter un blanchiment important par fluorescence. Pour ce faire, commencez par une valeur de test initiale de 2,5 mW de puissance pour FFN511 excité à 458 nm et de 1 mW pour mNG excité à 514 nm. Pour L’A655 excité à 633 nm avec un laser HeNe, utilisez une puissance laser élevée, ~12-15 mW (c’est-à-dire 70% à 80% du maximum), qui, à excitation continue, peut blanchir tout A655 fluorescent à l’intérieur d’un profil en forme de Ω lorsque son pore est fermé.
REMARQUE: Si la puissance du laser est trop élevée, la fluorescence PH-mNG et FFN511 sera blanchie rapidement. Si la puissance du laser est trop faible, les signaux seront trop faibles ou bruyants pour être analysés. - Ajouter 9 μL de solution interne (tableau 1) dans une pipette de raccordement et fixer la pipette au support dans l’étage de l’amplificateur à pince de raccordement (voir le tableau des matériaux).
- Appliquez une petite pression positive avec une seringue et déplacez l’embout de la pipette pour toucher la solution de bain avec un micromanipulateur. Assurez-vous que l’amplificateur montre que la résistance de la pipette est d’environ 2-4 MΩ avec un test d’impulsion de tension. Appuyez sur LJ/Auto pour annuler la jonction liquide.
- Déplacez la pipette vers la cellule sélectionnée avec le micromanipulateur. Pour former un mode attaché à la cellule, déplacez l’embout de la pipette pour toucher la cellule (la résistance augmentera); en appliquant doucement une pression négative avec la seringue (la résistance augmentera à plus de 1 GΩ), modifiez le potentiel de maintien de 0 à -80 mV.
- Une fois que la résistance passe 1 GΩ, attendez ~30 s pour que la configuration se stabilise. Appuyez sur C-fast/Auto pour compenser la capacité rapide.
- Pour former un mode à cellules entières, appliquez une pression négative pulsée courte mais puissante avec la seringue pour rompre la membrane (la forme de l’impulsion actuelle change avec un condensateur à membrane chargé et déchargé). Appuyez sur C-slow/Auto pour compenser la capacité lente.
- Ajustez légèrement la mise au point de l’imagerie pour faire la mise au point sur le fond de la cellule. Démarrez simultanément l’imagerie timelapse confocale et l’enregistrement patch-clamp en cliquant simultanément sur les boutons Démarrer des deux applications logicielles différentes.
REMARQUE: Le logiciel d’imagerie confocale fait un film à une vitesse d’environ 20-90 ms / image. L’enregistrement de la pince patch comprend l’état de repos pendant 10 s, la stimulation de dépolarisation de 1 s et 49 s supplémentaires après la stimulation. La configuration patch-clamp permet d’enregistrer le courant calcique, le saut de capacité et la désintégration induits par la dépolarisation de 1 s de -80 à +10 mV (Figure 3D). - Une fois l’enregistrement terminé, assurez-vous que les données sont enregistrées. Modifiez le potentiel de retenue à 0 mV. Retirez la pipette de la solution de bain et jetez-la.
- Répétez les étapes 4.7 à 4.13 pour enregistrer une autre cellule dans le plat. Après 1 h d’enregistrement, passez à un autre plat pour l’enregistrement.
REMARQUE: Après 1 h d’enregistrement, le taux de réussite de l’enregistrement patch-clamp diminue considérablement. Pour augmenter l’efficacité de la collecte de données, l’enregistrement pendant seulement 1 h est recommandé dans chaque plat.
5. Analyse des données patch-clamp
- Ouvrez un logiciel approprié (voir la table des matériaux) pour l’analyse des données. Cliquez sur le | PPT Charger le fichier | PULSE Boutons de fichier pour charger le fichier .dat. Cliquez sur Le faire et quatre traces seront automatiquement tracées dans un graphique, y compris les traces de courant de calcium et de capacité.
- Cliquez sur le | Windows Nouveaux boutons Graphique, choisissez le Pulse_1_1_1, la première vague dans Y Onde(s), puis cliquez sur Faire pour tracer le graphique courant de calcium. Cliquez sur le | Windows Nouveaux boutons Tableau, choisissez le Pulse_1_1_1, puis cliquez sur Faire pour afficher les données brutes du courant calcique, qui pourraient être utilisées pour tracer la trace moyenne de plusieurs cellules.
- Dessinez un carré en conséquence dans le graphique du courant de calcium, cliquez avec le bouton droit de la souris et développez le signal actuel pour inclure la ligne de base et le pic de courant de calcium. Cliquez sur | graphique Afficher les informations pour afficher les curseurs A et B et les déplacer vers la ligne de base et le pic respectivement. Les informations du graphique seront affichées en bas et les paramètres pourront être estimés.
- Répétez l’étape 5.2, mais choisissez la Pulse_1_1_1_Cm, la deuxième onde en Y Wave(s), pour tracer la trace de capacité. Répétez l’étape 5.3 et placez les curseurs A et B dans la position appropriée pour mesurer les paramètres de capacité, tels que la ligne de base, l’amplitude et la vitesse de désintégration.
- Copiez les données brutes de l’étape 5.2 dans une feuille de calcul, calculez la moyenne et l’erreur-type de la moyenne pour un groupe de cellules enregistrées et tracez les traces moyennes de courant calcique et de capacité membranaire (figure 3E) dans un logiciel approprié.
6. Analyse des données d’imagerie confocale
- Ouvrez les fichiers d’imagerie bruts avec n’importe quel logiciel fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Certains autres programmes gratuits, tels que ImageJ ou Fiji, pourraient être utilisés pour le traitement des données et la quantification des images obtenues dans la section 4. - Cliquez sur | de processus ProcessTools et utilisez les outils pour générer des fichiers de moyenne mobile (par exemple, une moyenne mobile pour 4 images) pour chaque image timelapse et enregistrer ces fichiers.
REMARQUE: Après la moyenne mobile, un ajustement approprié de la luminosité et de l’arrière-plan pourrait être effectué pour mieux montrer les changements de fluorescence de trois canaux, ce qui peut aider à identifier les événements de fusion. Vérifier l’intensité fluorescente dans certaines régions sans événement de fusion peut aider à distinguer le signal fluorescent des événements de fusion des signaux de fond. - Cliquez sur les boutons Quantifier | Outils | Profil de pile, vérifiez les points temporels avant et après la stimulation pour identifier les changements de fluorescence dans chaque canal. Cliquez sur le bouton Dessiner les ellipses pour encercler les régions d’intérêt (ROI) pour les événements de fusion. Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Enregistrer les retours sur investissement pour enregistrer les retours sur investissement.
REMARQUE: La taille du retour sur investissement, qui couvre les trois signaux fluorescents, était similaire à la taille des vésicules dans les cellules chromaffines24. Les données brutes ont été utilisées pour l’analyse, tandis que les données de moyenne mobile qui augmentent le rapport signal/bruit ont été fournies pour montrer clairement les trois signaux. - Cliquez sur Ouvrir les projets pour localiser le fichier brut, faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Charger les rois pour charger le fichier ROI dans les fichiers d’imagerie bruts afin de mesurer les intensités de fluorescence.
REMARQUE: Le signal fluorescent brut sera utilisé pour tracer des traces de différents canaux. Pour chaque retour sur investissement, la ligne de base est définie comme l’intensité avant la stimulation, et les traces d’intensité peuvent être normalisées à la ligne de base. - Cliquez sur Outils | Triez les retours sur investissement dans le logiciel et tracez les traces pour les trois canaux de chaque retour sur investissement. Cliquez sur Rapport pour enregistrer les données de retour sur investissement, y compris les données numériques et les traces d’imagerie pour chaque retour sur investissement, dans un dossier de fichiers.
- Identifier un événement de fusion par l’augmentation simultanée de l’intensité de la fluorescence ponctuelle PH-mNG (FPH) etA655 (F 655) (dans une seule image), accompagnée d’une diminution de la fluorescence ponctuelle FFN511 (FFFN).
- Recherchez l’apparence de FPH et F655, ce qui indique la formation de taches PH-mNG / A655 en raison d’un profil Ω généré par fusion, permettant la diffusion de PH-mNG de la membrane plasmique et la diffusion persistante de A655 du bain.
- Recherchez la diminution de laF FFN , qui indique sa libération d’une vésicule due à l’ouverture des pores de fusion et exclut la possibilité que l’apparition de FPH et F655 puisse provenir d’une invagination membranaire causée par une endocytose.
- Inspectez les imagesfixes XY/Z timelapse qui montrent les événements de fusion se produisant au fond de la cellule. Analysez trois modes d’événements de fusion : 1) fusion fermée, 2) fusion de séjour et 3) fusion de rétrécissement.
NOTE: Les événements de fusion ont rarement été observés avant la dépolarisation, alors que des dizaines d’événements de fusion ont pu être observés après la dépolarisation. Après la fusion, le profil Ω peut fermer son pore, maintenir son pore ouvert ou rétrécir pour se fondre dans la membrane plasmique.- Pour identifier la fusion étroite, recherchez la gradation F655 car la fermeture des pores de fusion empêche l’échange du bain A655, tandis que FPH se maintient, reflétant la conversion continue de PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(4)P, ou FPH se désintègre avec un retard, réfléchissant le pincement des vésicules (fusion étroite, Figure 4A,B).
- Recherchezle PH F soutenu et le F655 pour identifier la fusion par séjour (Figure 4C).
- Recherchez des diminutions parallèles de FPH et F655, indiquant un retrait de profil Ω pour identifier la fusion de rétrécissement (Figure 4D).
REMARQUE : Vérifiez les fichiers d’imagerie d’origine pour inspecter les traces d’imagerie si le type d’événement n’est pas certain. La vérification de l’intensité fluorescente dans certaines régions sans événement de fusion peut aider à distinguer le signal fluorescent des événements de fusion des signaux de fond.
- Tracez des traces représentatives des changements d’intensité pour ces trois canaux : FFN511, PH-mNG et A655. Quantifiez le pourcentage de différents modes de fusion dans chaque cellule et tracez les figures.
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Representative Results
À la suite des procédures expérimentales illustrées aux figures 1 et 2, les cellules chromaffines des glandes surrénales bovines ont été transfectées avec du PH-mNG pour marquer la membrane plasmique; L’A655 a été ajouté à la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion; et le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 a été chargé dans les vésicules pour la détection de la libération. Ensuite, l’imagerie du timelapse confocal sur plan XY de FFN511, PH-mNG et A655 a été effectuée toutes les 20 à 90 ms au fond de la cellule (plan focal Z ~ 100-200 nm au-dessus de la membrane cellulaire). L’enregistrement et l’application d’une dépolarisation de 1 s de -80 à +10 mV ont été effectués pour évoquer l’exo- et l’endocytose (Figure 3A-C). Cette dépolarisation a induit un courant de calcium vers l’intérieur, un saut de capacité qui indique une exocytose et une désintégration de capacité après le saut qui indique une endocytose (Figure 3D, E).
Avec l’imageriefixe XY/Z timelapse au fond de la cellule, de nombreux événements de fusion individuels ont été observés 8,24 après dépolarisation (figure 4A), tandis que de rares événements de fusion ont été observés avant la dépolarisation. Les événements de fusion induits par le protocole de dépolarisation 1 s ont été identifiés comme une diminution de la fluorescence ponctuelle FFN511 (FFFN) reflétant la libération de FFN511, accompagnée d’une augmentationde la fluorescence ponctuelle F ph etA655 (F 655) reflétant la diffusion PH-mNG et A655 de la membrane plasmique et de la solution de bain dans la vésicule de fusion (le profil Ω généré par la fusion)15.
Après la fusion, le profil Ω généré par la fusion des vésicules avec la membrane plasmique peut 1) fermer son pore, appelé fusion fermée, 2) maintenir un pore de fusion ouvert, appelé stay-fusion, ou 3) rétrécir pour fusionner dans la membrane plasmique, appelée shrink-fusion. La fusion rapprochée a été identifiée comme une gradation F655 tandis que lePH F se maintenait ou se désintégrait avec un retard (figure 4B). La fusion de séjour a été détectée comme la présence soutenue de taches PH-mNG et A655 (figure 4C). La fusion rétractable a été détectée sous forme de désintégration parallèle duPH F et du F655 accompagnée d’une réduction parallèle de la taille du spot PH-mNG et du spot A655 (Figure 4D)8,15,16,24.
Figure 1 : Représentation schématique du protocole expérimental. (A, B) Les glandes surrénales bovines sont taillées avec des ciseaux pour enlever le tissu adipeux (A), rincées avec la solution de Locke et digérées par la veine surrénale (B). (C) L’intérieur d’une glande surrénale sans digestion (à gauche) ou après une bonne digestion (à droite). (D) Après avoir été lavées et digérées, les médules sont isolées et hachées en petits morceaux, et les cellules chromaffines sont séparées des médullos émincées après filtration et centrifugation. (E) Les cellules chromaffines sont électroporées et plaquées sur des couvercles pour l’incubation. (F) Les jours 2 à 3, vérifiez les cellules chromaffines au microscope avant l’expérimentation. (G) L’échantillon de cellule est intégré dans la chambre pour l’enregistrement par pince de patch et l’imagerie confocale. Les changements de courant calcique et de capacité sont enregistrés, amplifiés et affichés sur le moniteur. Les changements de fluorescence lors de la stimulation sont détectés et affichés sur le moniteur. Barres d’échelle = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Patch-clamp et configuration confocale. (A) Le jour de l’expérimentation, les cellules chromaffines cultivées sur des couvercles sont incubées avec FFN511 pendant 20 min. Le colorant A655 est ajouté à la solution de bain. (B) Les cellules chromaffines sur le couvercle sont transférées dans une chambre d’enregistrement et la solution de bain avec A655 est ajoutée à la chambre. (C) Après avoir ajouté une goutte d’huile sur l’objectif d’immersion dans l’huile 100x, la chambre est montée sur la scène d’un microscope confocal inversé. La pointe du fil de terre est immergée dans une solution de bain. La pipette est mise en position après le chargement avec une solution de pipette et maintenue par un porte-pipette, qui est attaché à une tête. La scène de tête est contrôlée par un micromanipulateur motorisé. (D) Après avoir trouvé une bonne cellule, déplacez l’embout de la pipette dans la solution de bain avec le micromanipulateur pour commencer l’enregistrement de la pince à patch à cellules entières et l’imagerie confocale. Barres d’échelle = 10 mm (A), 5 mm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Enregistrements des courants de calcium et des changements de capacité induits par la dépolarisation. (A) Dessin de configuration des cellules chromaffines pendant l’enregistrement de la pince de tension de cellule entière. La cellule chromaffine est immergée dans une solution de bain contenant de l’A655 (rouge), et la membrane cellulaire et les vésicules sont marquées avec PH-mNG (vert) et FFN511 (cyan), respectivement. Cette image a été modifiée avec la permission de 24. (B) Image représentative d’une cellule chromaffine à patch serrée observée par champ lumineux. (C) Images représentatives de PH-mNG (vert), A655 (rouge) et FFN511 (cyan) dans une cellule avec une bonne mise au point au niveau de l’empreinte cellulaire. (D) Exemple de changements de courant calcique et de capacité induits par une dépolarisation de 1 s de -80 à +10 mV. (E) Les traces moyennes de courants de calcium (ICa) et de changements de capacité (Cm) recueillies à partir de 20 cellules chromaffines. Cette image a été modifiée avec la permission de 26. Barres d’échelle = 5 μm (B, C). Abréviations: ICa = courant de calcium; Cm = capacité; Depol = dépolarisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Visualisation des événements de fusion au microscope confocal. (A) De nombreuses taches de fusion peuvent être détectées avec l’imagerie confocale du plan XY de PH-mNG (vert), A655 (rouge) et FFN511 (cyan) au fond de la cellule. La fusion a été évoquée par une dépolarisation de 1 s de -80 à +10 mV (depol1s). Les taches FFN ont subi une libération et une fusion rapprochée (cercles). Les images avant (-1 s) et après (+1 s et +10 s) dépolarisation sont montrées. (B) Un exemple de fusion rapprochée. (C) Un exemple de stay-fusion. (D) Un exemple de rétrécissement-fusion. Cette image a été modifiée avec la permission de 24. Barres d’échelle = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Abréviations : Depol = dépolarisation ; F = intensité fluorescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Moyen/Solution | Description | ||
| La solution de Locke | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM de glucose et 10 mM HEPES, pH 7,3, ajusté avec NaOH | ||
| Solution enzymatique | 1,5 mg/mL de collagénase P, 0,325 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine et 5 mg/mL d’albumine sérique bovine dans la solution de Locke | ||
| Milieu de culture | Milieu DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal | ||
| Solution interne | 130 mM Cs-glutamate, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP et 0,5 mM GTP, pH 7,2, ajusté avec CsOH | ||
| Solution de bain | 125 mM NaCl, 10 mM de glucose, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl et 20 mM DE TEA, pH 7,3, ajusté avec NaOH | ||
Tableau 1 : Détails concernant la composition du milieu de culture et des solutions.
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Discussion
Une méthode d’imagerie microscopique confocale est décrite pour détecter la dynamique des pores de fusion et de la libération du transmetteur, ainsi que trois modes de fusion, la fusion rapprochée, la fusion de séjour et la fusion rétractable dans les cellules chromaffines surrénales bovines 4,24. Une méthode électrophysiologique pour dépolariser la cellule et ainsi évoquer l’exo- et l’endocytose est décrite. Le traitement systématique des images confocales fournit des informations sur les différents modes de comportement des pores pour les événements de fusion et de fission.
La surveillance simultanée des changements de courant calcique et de capacité dans la même cellule avec la configuration de la cellule entière fournit des informations supplémentaires sur l’exo- et l’endocytose, impliquant le rapport d’ouverture et de fermeture des pores au niveau de la cellule entière à un moment donné. Ces méthodes sont, en principe, applicables à d’autres cellules excitables et à des cellules non excitables en culture primaire ou dans des lignées cellulaires contenant des vésicules d’environ 200 à 1 600 nm15. En plus des cellules chromaffines, la méthode décrite ici a été appliquée à une lignée de cellules bêta pancréatiques de rat, les cellules INS-14.
En principe, la méthode peut également être appliquée à des cellules sécrétoires contenant des vésicules inférieures à 200 nm. Cependant, comme la taille de la vésicule est réduite, le rapport signal/bruit peut être trop faible pour une détection fiable. L’imagerie à super-résolution au lieu de l’imagerie confocale peut devenir nécessaire. Jusqu’à présent, les méthodes décrites ici n’ont pas été appliquées aux synapses contenant des vésicules synaptiques d’environ 40 nm.
La mise en œuvre réussie de la méthode décrite ici dépend essentiellement de plusieurs étapes générales, telles que la qualité de la cellule de culture, l’efficacité de la transfection plasmidique et le taux de réussite de l’enregistrement électrophysiologique. Tout d’abord, les cellules saines sont vitales pour l’enregistrement de patch-clamp et l’imagerie confocale. Il n’est pas conseillé d’utiliser des agents antibactériens ou antifongiques pendant la culture, car ces produits chimiques peuvent affecter l’excitabilité des cellules chromaffines. Ainsi, l’exercice diligent de la technique stérile et l’utilisation de milieux fraîchement préparés sont importants. Bien que les cellules chromaffines de culture primaire puissent survivre dans les boîtes pendant au moins une semaine25, il est important pour les nouveaux utilisateurs d’utiliser des cellules les jours 2 à 3 pour les expériences. Au fur et à mesure que les fibroblastes se développent progressivement, il devient plus difficile d’établir la configuration de la pince patch-clamp à cellules entières. Deuxièmement, l’efficacité d’électroporation des plasmides dans les cellules chromaffines est d’environ 20 à 30%. L’efficacité de l’électroporation doit être optimisée si elle est trop faible ou si la fluorescence PH-mNG est trop faible. Troisièmement, les cellules ont été imagées à leur fond avec un objectif d’huile 100x pour obtenir des événements substantiels indiqués par des changements dans trois sondes fluorescentes: FFN511, PH-mNG et A655. Bien que DIC offre une vue plus claire que l’imagerie en champ clair ou à l’œil nu lors de l’établissement de la configuration de la cellule entière, toute technique de visualisation permettant à l’utilisateur d’établir la configuration est suffisante.
Une puissance laser appropriée est vitale pour l’imagerie confocale dans les cellules vivantes. Comme FFN511 et mNG peuvent être blanchis par une puissance laser élevée, il est préférable de rechercher une bonne cellule avec épifluorescence avant la visualisation avec des lasers confocaux. Pour l’A655, une excitation laser de haute puissance est nécessaire pour blanchir le colorant à l’intérieur des vésicules. En outre, la raison la plus courante pour laquelle cette expérience échoue est une défaillance de l’enregistrement de patch-clamp. Une pointe de pipette propre et polie de la bonne taille et la pratique générant la configuration de cellules entières sur des cellules chromaffines sont des facteurs clés. Bien que cela puisse prendre un certain temps et des efforts pour réussir, une fois établies, ces expériences fournissent des données substantielles concernant les événements de fusion et de fission, indiquant l’ouverture et la fermeture des pores de la membrane à un seul niveau d’événement.
Le protocole décrit ici peut être utilisé avec quelques modifications pour poursuivre différents objectifs expérimentaux. Cependant, quels que soient les objectifs expérimentaux, il est conseillé d’utiliser d’abord une solution riche en potassium (comme 70 mM KCl) comme stimulus pour voir les changements que la membrane subit lors de la dépolarisation, en veillant à ce que les changements d’intensité dans ces trois colorants, FFN, PH et A655, puissent être visualisés. La membrane plasmique peut être marquée avec d’autres fluorophores liant la membrane, tels que mCLING (groupe fluorophore-cystéine-lysine-palmitoyl liant la membrane)4,27 ou CAAX (un motif protéique qui cible la membrane plasmique face au cytosol via l’isoprénylation des résidus de cystéine)4,28. L’A655 peut être remplacé par d’autres colorants de spectres différents, tels que l’Atto 532 (A532), en fonction de la combinaison de molécules fluorescentes utilisée dans certaines expériences15. Le neuropeptide Y peut être utilisé à la place de faux neurotransmetteurs fluorescents16.
FFN511 a été excité à 458 nm au lieu de 405 nm dans cette expérience, même si le spectre d’excitation de crête de FFN511 est d’environ 405 nm. L’étude avec enregistrement de la capacité n’a montré aucune différence significative dans les cellules chromaffines avec ou sans PH-mNG, ce qui indique que la surexpression de PH-mNG n’affecte pas l’exocytose et l’endocytose15,24. Des pourcentages similaires pour les événements de fusion ont été vérifiés dans des cellules chromaffines marquées avec PH-mNG et A532 uniquement ou avec FFN511, démontrant que le chargement de FFN511 dans des vésicules chromaffines n’affecte pas la libération de contenu et les différents modes de fusion16. La stimulation de dépolarisation 1 s peut être remplacée par une solution riche en potassium ou d’autres pattens de dépolarisation. Ces modifications peuvent être utilisées pour s’adapter à différents objectifs expérimentaux.
Malgré les avantages de cette méthode puissante, elle présente certaines limites. La plus grande limitation est liée à la résolution limitée par diffraction (~ 230 nm) de la microscopie confocale, qui peut être surmontée par des techniques de microscopie à super-résolution plus avancées29. Le diamètre des granules dans les cellules chromaffines bovines est d’environ 300 nm6, ce qui permet d’observer l’ouverture et la fermeture des pores membranaires dans la résolution spatiale de la microscopie confocale. Cependant, les vésicules synaptiques sont ~ 30-60 nm30, ce qui est au-delà de la résolution confocale. L’extension de ces mesures d’imagerie de cellules vivantes à de petites vésicules synaptiques s’avère difficile avec l’imagerie confocale.
Des techniques d’imagerie de cellules vivantes avec une meilleure résolution temporelle et/ou spatiale, telles que la microscopie STED, la microscopie stochastique à reconstruction optique (STORM), la microscopie de localisation photoactivée (PALM), la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) et la nanoscopie à flux minimal de photons (MINFLUX) ont été développées et peuvent être appliquées à cette méthode 31,32,33,34 . En effet, la microscopie STED a été utilisée pour révéler la dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines. Les différents modes d’événements de fusion et de fermeture préformée Ω profil peuvent être vérifiés à l’aide de la microscopie à super-résolution telle que la microscopie STED24. D’autres limitations incluent le photoblanchiment et la cytotoxicité des protéines et des colorants fluorescents.
Cette combinaison d’électrophysiologie et de microscopie confocale peut être largement appliquée à de nombreuses cellules sécrétoires. La combinaison de la microscopie à super-résolution avec les méthodes décrites ici serait un outil précieux pour mesurer la dynamique des pores de fusion dans les circuits neuronaux à l’avenir, à condition que la microscopie à super-résolution se développe à un point tel qu’elle puisse résoudre le pore de fusion aux terminaisons nerveuses.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les programmes de recherche intra-muros du NINDS (ZIA NS003009-13 et ZIA NS003105-08) d’avoir soutenu ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
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