Les cartes mycorhiziennes comme outil pour explorer les modèles de colonisation et les stratégies fongiques dans les racines de Festuca rubra et Zea mays

Summary

Le protocole décrit ici les méthodes d’évaluation des modèles et de la stratégie de colonisation mycorhizienne arbusculaire dans les racines de deux espèces: Zea mays et Festuca rubra. L’utilisation de la méthode MycoPatt permet le calcul de paramètres, la conversion de structures mycorhiziennes en données numériques et la cartographie de leur position réelle dans les racines.

Abstract

Les champignons mycorhiziens arbusculaires sont des symbiotes dans les racines des plantes. Leur rôle est de soutenir le développement de l’hôte et de maintenir l’équilibre nutritionnel dans les écosystèmes. Le processus de colonisation dépend de plusieurs facteurs tels que l’écologie du sol, la diversité génétique des champignons et de l’hôte, et les pratiques agronomiques. Leur action synchronisée conduit au développement d’un réseau hyphe complexe et conduit au développement secondaire de vésicules et d’arbuscules dans les cellules racinaires. Le but de cette recherche était d’analyser l’efficacité de la méthode des motifs mycorhiziens (MycoPatt) pour le positionnement des structures fongiques dans les racines de Festuca rubra et Zea mays. Un autre objectif était d’explorer la stratégie de colonisation fongique révélée par les cartes mycorhiziennes de chaque espèce. L’acquisition et l’assemblage de multiples images microscopiques permettent d’évaluer la colonisation mycorhizienne chez les plants de maïs et de fétuque rouge afin de fournir des informations sur la position réaliste des structures développées. Les schémas mycorhiziens observés mettent en évidence l’efficacité variable de chaque plante en termes de développement de connexions avec les champignons symbiotiques du sol, causées par les traitements appliqués et le stade de croissance. Les cartes détaillées mycorhiziennes obtenues par la méthode MycoPatt sont utiles pour la détection précoce de l’efficacité des plantes dans l’acquisition symbiotique du sol.

Introduction

Les mycorhizes arbusculaires (MA) sont une catégorie d’endophytes terricoles qui sont constamment un domaine d’intérêt pour les chercheurs. Leur présence dans les racines de la plupart des plantes et leur implication dans les cycles des nutriments en font des composantes essentielles de la stabilité de tout écosystème où des plantes herbacées sont présentes ^1,2. Grâce à leur mycélium extra-radiculaire, la FA agit comme une extension fongique pour les racines des plantes, en particulier dans les zones difficiles d’accès³. L’activité principale est dans les racines des plantes hôtes, où la FA développe de grands réseaux d’hyphes et des structures intracellulaires spécifiques appelées arbuscules. Le manque de spécificité de l’hôte permet au symbiote de coloniser plusieurs espèces en même temps. Cette capacité confère à la FA le rôle de l’allocation des ressources et de la régulation des nutriments dans l’écosystème; Le champignon fournit également un soutien à la survie des plantes et aide à la performance des plantes 4,5,6,7. La réaction des espèces AM aux racines hôtes est visible dans l’extension et l’emplacement du mycélium intra-radiculaire et la présence et la forme des arbuscules développés intracellulairement. Les arbuscules intracellulaires agissent comme un point d’échange entre les deux symbiotes et représentent des zones caractérisées par des processus de transfert rapides. Les structures produites par l’AM dépendent de l’espèce et, en plus des arbuscules, dans les racines, elles développent également des vésicules, des spores et des cellules auxiliaires.

L’évaluation des symbiotes AM dans les racines des plantes ^8,9 présente de nombreux défis. Le premier est leur développement constant pendant toute la période de végétation des hôtes, ce qui entraîne de multiples changements dans la structure arbusculaire hyphe. Les différents stades de croissance arbusculaire, jusqu’à leur effondrement, sont clairement présents dans les racines, mais les structures AM sénescentes sont parfois digérées, ce qui ne les rend que partiellement visibles¹⁰. Le deuxième défi est représenté par la méthode et le protocole de coloration, la grande diversité des systèmes racinaires, la dimension de leurs cellules et les différences d’épaisseur, qui rendent difficile la proposition d’une méthode unifiée. Le dernier défi est représenté par l’évaluation et la notation de la colonisation de la FA. Il existe de nombreuses méthodes qui notent la FA avec différents degrés d’objectivité, et la plupart d’entre elles sont encore limitées aux techniques de microscopie. Les plus simples sont basés sur la présence / absence de structures dans le cortex racinaire, tandis que les plus complexes sont basés sur la notation visuelle et l’utilisation de classes de colonisation, avec l’intégration de la fréquence et de l’intensité du phénomène de colonisation. De nombreuses données ont été produites au cours des dernières décennies sur le statut mycorhizien de plusieurs espèces, mais la plupart des méthodes sont limitées à la valeur observée de la colonisation sans indiquer la position réelle de chaque structure dans le cortex racinaire. En réponse à la nécessité de résultats plus précis sur la colonisation de la MA, une méthode basée sur l’analyse microscopique des motifs mycorhiziens (MycoPatt) dans les racines a été développée pour assembler, sous forme numérique, les cartes mycorhiziennes détaillées¹¹. En outre, la méthode permet le calcul objectif des paramètres de colonisation et la détermination de la position réelle de chaque structure dans la racine.

La position des structures fongiques AM peut être importante pour répondre aux deux questions suivantes. La première est liée à l’analyse de la colonisation à un moment précis du cycle de végétation d’une plante. Dans ce contexte, il est très utile d’observer l’abondance des arbusculaires / vésicules, de signaler comment elles sont situées dans la racine et de fournir une image et des paramètres de colonisation très clairs. La seconde est liée à la détection de la stratégie fongique et de son orientation et même à la prévision de son développement futur. Une application du MycoPatt peut être pour les plantes analysées quotidiennement, tous les 2-3 jours, chaque semaine ou pendant divers stades de croissance. Dans ce contexte, l’emplacement des vésicules/arbuscules est important pour mieux comprendre le mécanisme biologique de la colonisation par la MA. Ces paramètres et observations sont très utiles pour compléter les paramètres mathématiques.

Le but de cet article est de démontrer la capacité du système MycoPatt à explorer le potentiel et la stratégie de colonisation des champignons AM indigènes dans les racines de Zea mays (maïs) à différents stades de développement et dans les racines de Festuca rubra (fétuque rouge) dans différentes conditions de fécondation à long terme. Pour atteindre cet objectif, deux grandes bases de données issues de deux expériences ont été analysées. L’expérience sur le maïs a été établie à Cojocna (46°44′56 » lat. N et 23°50′0 » de long. E), dans la ferme didactique expérimentale de l’Université des sciences agricoles et de médecine vétérinaire de Cluj sur un phaeoziom avec un sol à texture limoneuse¹². L’expérience sur la fétuque rouge fait partie d’un site expérimental plus vaste établi en 2001 à Ghețari, dans les montagnes Apuseni (46°49’064 » lat. N et 22°81’418” de long. E), sur un sol préluvosol (terra rossa) de type^13,14. Le maïs a été récolté dans cinq phénophases de croissance^{différentes 12} : B1 = 2-4 feuilles (comme point de contrôle pour le début de la colonisation mycorhizienne); B2 = 6 feuilles; B3 = 8-10 feuilles; B4 = formation d’épis; B5 = maturité physiologique. À partir du stade 2-4 feuilles (A0), un traitement organique a été appliqué, ce qui a entraîné un facteur de graduation à deux (A1 = témoin et A2 = traité). Les racines de fétuque rouge ont été recueillies à la floraison à partir d’une expérience avec cinq fertilisations à long terme^13,14: V1 = témoin^, non fertilisé; V2 = 10 t·^ha-1 fumier; V3 = 10 t·ha-1 fumier + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 fumier + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Cinq plantes ont été collectées à chaque stade de développement de chaque variante de fertilisation. Les protocoles de coloration et leur performance en termes de temps de traitement des échantillons et de qualité de coloration ont été analysés. La relation entre le développement des hyphes AM et la présence de ses structures dans les racines a été analysée séparément pour chaque espèce et s’est poursuivie avec l’identification des racines les plus permissives pour la colonisation. Les modèles de colonisation spécifiques de chaque système racinaire ont été analysés en fonction des cartes de colonisation et de la valeur des paramètres AM.

Le maïs est une plante annuelle, ce qui implique une croissance continue des racines, et c’était la principale raison d’appliquer le MycoPatt dans les stades de croissance. La fétuque rouge est une plante vivace provenant d’une prairie traitée depuis longtemps avec différents engrais. Ses racines ont un développement plus court de 1 an, et l’anthèse est considérée comme le point de végétation lorsque la plante change son métabolisme de végétatif à génératif. Pour capturer ces plantes pendant ces périodes d’activité intense, les points temporels susmentionnés ont été choisis. L’échantillonnage pendant la période de végétation est difficile pour cette espèce lorsqu’elle est cultivée dans des prairies naturelles.

Protocol

1. Sélection du matériel biologique, échantillonnage des racines et entreposage Recueillir toute la racine des plantes à l’aide d’une pelle (figure 1A) séparément pour chaque variante et la répliquer. Retirez doucement, à la main, les gros agrégats de terre des racines. Lavez tout le système racinaire et mesurez-le sur une échelle avec des cellules de 1 cm x 1 cm (Figure 1B). Coupez les racines séparément pour chaque p…

Representative Results

L’utilisation correcte de la méthode de broyage doux des racines après les procédures de coloration fournit de bons détails sur les structures mycorhiziennes, à la fois pour Zea mays (Figure 8A-C) et Festuca rubra (Figure 9A-E), un bon contraste entre les structures mycorhiziennes et les cellules racinaires, et une confirmation de la stèle due à la couleur bleue. Si le…

Discussion

Les études sur la colonisation mycorhizienne sont vitales pour le développement de nouvelles stratégies dans le domaine agronomique. Le potentiel de multiples plantes cultivées à former une association symbiotique avec les mycorhizes arbusculaires en a fait une composante importante du développement durable de l’agroécosystème et du maintien de sa santé 16,17,18,19,20.<sup…

Materials

Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb