Mappe micorriziche come strumento per esplorare i modelli di colonizzazione e le strategie fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays
Summary
Il protocollo qui descrive i metodi per la valutazione dei modelli di colonizzazione micorrizica arbuscolare e la strategia nelle radici per due specie: Zea mays e Festuca rubra. L’uso del metodo MycoPatt consente il calcolo dei parametri, la conversione delle strutture micorriziche in dati digitali e la mappatura della loro posizione reale nelle radici.
Abstract
I funghi micorrizici arbuscolari sono simbionti nelle radici delle piante. Il loro ruolo è quello di sostenere lo sviluppo dell’ospite e mantenere l’equilibrio nutrizionale negli ecosistemi. Il processo di colonizzazione dipende da diversi fattori come l’ecologia del suolo, la diversità genetica dei funghi e dell’ospite e le pratiche agronomiche. La loro azione sincronizzata porta allo sviluppo di una complessa rete ifica e porta allo sviluppo secondario di vescicole e arbuscoli nelle cellule radicali. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di analizzare l’efficienza del metodo MycoPatt (pattern micorrizici) per il posizionamento di strutture fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays. Un altro obiettivo era quello di esplorare la strategia di colonizzazione fungina come rivelato dalle mappe micorriziche di ciascuna specie. L’acquisizione e l’assemblaggio di più immagini microscopiche consentono la valutazione della colonizzazione micorrizica sia nelle piante di mais che in quelle di festuca rossa per fornire informazioni sulla posizione realistica delle strutture sviluppate. I pattern micorrizici osservati evidenziano l’efficienza variabile di ogni pianta in termini di sviluppo di connessioni con funghi simbiotici del suolo, causati da trattamenti applicati e fase di crescita. Le mappe dettagliate micorriziche ottenute attraverso il metodo MycoPatt sono utili per la diagnosi precoce dell’efficienza delle piante nell’acquisizione simbiotica dal suolo.
Introduction
I funghi micorrize arbuscolari (AM) sono una categoria di endofiti del suolo che sono costantemente un’area di interesse per i ricercatori. La loro presenza nelle radici della maggior parte delle piante e il loro coinvolgimento nei cicli dei nutrienti le rende componenti vitali per la stabilità di ogni ecosistema in cui sono presenti piante erbacee 1,2. Attraverso il loro micelio extra-radicolare, AM agisce come un’estensione fungina per le radici delle piante, specialmente nelle aree difficili da raggiungere3. L’attività principale è nelle radici delle piante ospiti, dove AM sviluppa grandi reti ife e specifiche strutture intracellulari chiamate arbuscoli. La mancanza di specificità dell’ospite consente al simbionte di colonizzare più specie contemporaneamente. Questa capacità fornisce all’AM il ruolo dell’allocazione delle risorse e della regolazione dei nutrienti nell’ecosistema; Il fungo fornisce anche supporto nella sopravvivenza delle piante e aiuta nelle prestazioni della pianta 4,5,6,7. La reazione delle specie AM alle radici ospiti è visibile nell’estensione e nella posizione del micelio intra-radicolare e nella presenza e nella forma degli arbuscoli sviluppati intracellulari. Gli arbuscoli intracellulari fungono da punto di interscambio tra i due simbionti e rappresentano aree caratterizzate da processi di trasferimento rapidi. Le strutture che l’AM produce sono specie-dipendenti e, oltre agli arbuscoli, nelle radici, sviluppano anche vescicole, spore e cellule ausiliarie.
Ci sono molte sfide nella valutazione dei simbionti AM nelle radici delle piante 8,9. Il primo è il loro costante sviluppo durante l’intero periodo vegetativo degli ospiti, che porta a molteplici cambiamenti nella struttura arbuscolare ifale. I diversi stadi di crescita arbuscolare, fino al loro collasso, sono chiaramente presenti nelle radici, ma le strutture senescenti AM sono talvolta digerite, il che le rende solo parzialmente visibili10. La seconda sfida è rappresentata dal metodo e dal protocollo di colorazione, dalla grande diversità dei sistemi radicali, dalla dimensione delle loro cellule e dalle differenze di spessore, che rendono difficile proporre un metodo unificato. L’ultima sfida è rappresentata dalla valutazione e dal punteggio della colonizzazione AM. Esistono numerosi metodi che valutano AM con diversi gradi di obiettività e la maggior parte di essi sono ancora limitati alle tecniche di microscopia. Quelli semplici si basano sulla presenza/assenza di strutture nella corteccia radicolare, mentre quelli più complessi si basano sul visual scoring e sull’uso di classi di colonizzazione, con l’integrazione della frequenza e dell’intensità del fenomeno di colonizzazione. Negli ultimi decenni sono stati prodotti molti dati sullo stato micorrizico di più specie, ma la maggior parte dei metodi sono limitati al valore osservato della colonizzazione senza indicare la posizione reale di ciascuna struttura nella corteccia radicale. Come risposta alla necessità di risultati più accurati sulla colonizzazione AM, è stato sviluppato un metodo basato sull’analisi microscopica dei pattern micorrizici (MycoPatt) nelle radici per assemblare, in forma digitale, le mappe micorriziche dettagliate11. Inoltre, il metodo consente il calcolo oggettivo dei parametri di colonizzazione e la determinazione della posizione effettiva di ciascuna struttura nella radice.
La posizione delle strutture fungine AM può essere importante per rispondere alle seguenti due domande. Il primo è legato all’analisi della colonizzazione in un momento specifico dal ciclo vegetativo di una pianta. In questo contesto, è molto utile osservare l’abbondanza arbuscolare / vescicolare, segnalare come si trovano nella radice e fornire un’immagine e parametri di colonizzazione molto chiari. Il secondo è legato al rilevamento della strategia fungina e al suo orientamento e persino alla previsione del suo sviluppo futuro. Un’applicazione del MycoPatt può essere per le piante analizzate quotidianamente, ogni 2-3 giorni, settimanalmente o durante varie fasi di crescita. In questo contesto, la posizione delle vescicole/arbuscole è importante per comprendere meglio il meccanismo biologico della colonizzazione AM. Questi parametri e osservazioni sono molto utili per integrare i parametri matematici.
Lo scopo di questo articolo è dimostrare la capacità del sistema MycoPatt di esplorare il potenziale e la strategia di colonizzazione dei funghi AM nativi nelle radici di Zea mays (mais) durante le diverse fasi di sviluppo e nelle radici di Festuca rubra (festuca rossa) in diverse condizioni di fecondazione a lungo termine. Per raggiungere l’obiettivo, sono stati analizzati due grandi database di due esperimenti. L’esperimento del mais fu stabilito a Cojocna (46°44′56″ lat. N e 23°50′0″ di lunghezza. E), nella Fattoria Didattica Sperimentale dell’Università di Scienze Agrarie e Medicina Veterinaria Cluj su un feoziom con un terreno a tessitura argillosa12. L’esperimento della festuca rossa fa parte di un più ampio sito sperimentale istituito nel 2001 a Ghețari, sui Monti Apuseni (46°49’064″ lat. N e 22°81’418” di lunghezza. E), su terreno preluvosol (terra rossa) tipo13,14. Il mais è stato raccolto in cinque diverse fenofasi di crescita12: B1 = 2-4 foglie (come punto di controllo per l’inizio della colonizzazione micorrizica); B2 = 6 foglie; B3 = 8-10 foglie; B4 = formazione di pannocchie; B5 = maturità fisiologica. A partire dalla fase di 2-4 foglie (A0), è stato applicato un trattamento organico, che ha portato a un fattore di due graduazioni (A1 = controllo e A2 = trattato). Le radici della festuca rossa sono state raccolte alla fioritura da un esperimento con cinque concimazioni a lungo termine13,14: V1 = controllo, non fecondato; V2 = 10 t·ha-1 letame; V3 = 10 t·ha-1 letame + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 letame + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Cinque piante sono state raccolte in ogni fase di sviluppo da ogni variante di fertilizzazione. Sono stati analizzati i protocolli di colorazione e le loro prestazioni in termini di tempo di elaborazione del campione e qualità della colorazione. La relazione tra lo sviluppo delle ife AM e la presenza delle sue strutture nelle radici è stata analizzata separatamente per ciascuna specie ed è proseguita con l’identificazione delle radici più permissive per la colonizzazione. I modelli di colonizzazione specifici di ciascun sistema di root sono stati analizzati in base alle mappe di colonizzazione e al valore dei parametri AM.
Il mais è una pianta annuale, che implica una crescita continua delle radici, e questa è stata la ragione principale per applicare il MycoPatt nelle fasi di crescita. La festuca rossa è una pianta perenne proveniente da una prateria trattata a lungo con diversi fertilizzanti. Le sue radici hanno uno sviluppo più breve di 1 anno e l’antesi è considerata come il punto di vegetazione quando la pianta cambia il suo metabolismo da vegetativo a generativo. Per catturare queste piante durante questi intensi periodi di attività, sono stati scelti i punti temporali sopra menzionati. Il campionamento durante il periodo vegetativo è difficile per questa specie se coltivata in praterie naturali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi sulla colonizzazione micorrizica sono vitali per lo sviluppo di nuove strategie in campo agronomico. Il potenziale di più piante coltivate di formare un’associazione simbiotica con le micorrize arbuscolari le ha rese una componente importante dello sviluppo sostenibile dell’agroecosistema e del mantenimento della sua salute 16,17,18,19,20. Pertanto,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo articolo utilizza i dati risultanti da due studi di dottorato nell’area tematica “Corn Mycorrhizal Patterns Driven by Agronomic Inputs”, condotto da Victoria Pop-Moldovan, e “Mycorrhizal Status and Development of Colonization in Mountain Grassland Dominant Species”, condotto da Larisa Corcoz, sotto il coordinamento della Prof. Dr. Roxana Vidican.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
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