Mykorrhizakarten als Werkzeug zur Erforschung von Besiedlungsmustern und Pilzstrategien in den Wurzeln von Festuca rubra und Zea mays

Summary

Das Protokoll beschreibt hier die Methoden zur Beurteilung der arbuskulären Mykorrhiza-Besiedlungsmuster und -Strategien in Wurzeln für zwei Arten: Zea mays und Festuca rubra. Der Einsatz der MycoPatt-Methode ermöglicht die Berechnung von Parametern, die Umwandlung von Mykorrhizastrukturen in digitale Daten und die Kartierung ihrer realen Position in Wurzeln.

Abstract

Arbuskuläre Mykorrhizapilze sind Symbionten in den Wurzeln von Pflanzen. Ihre Aufgabe ist es, die Wirtsentwicklung aufrechtzuerhalten und das Ernährungsgleichgewicht in den Ökosystemen aufrechtzuerhalten. Der Besiedlungsprozess hängt von mehreren Faktoren wie der Bodenökologie, der genetischen Vielfalt der Pilze und des Wirts sowie agronomischen Praktiken ab. Ihre synchronisierte Wirkung führt zur Entwicklung eines komplexen Hyphennetzwerks und zur sekundären Entwicklung von Vesikeln und Arbuskeln in den Wurzelzellen. Ziel dieser Forschung war es, die Effizienz der Mykorrhizamuster-Methode (MycoPatt) zur Positionierung von Pilzstrukturen in den Wurzeln von Festuca rubra und Zea mays zu analysieren. Ein weiteres Ziel war es, die Pilzbesiedlungsstrategie zu erforschen, wie sie durch Mykorrhizakarten jeder Art sichtbar wird. Die Aufnahme und Assemblage mehrerer mikroskopischer Bilder ermöglicht die Beurteilung der Mykorrhizabesiedlung sowohl in Mais- als auch in Rotschwingelpflanzen, um Informationen über die realistische Position der entwickelten Strukturen zu liefern. Die beobachteten Mykorrhizamuster unterstreichen die unterschiedliche Effizienz jeder Pflanze in Bezug auf die Entwicklung von Verbindungen mit symbiotischen Bodenpilzen, die durch angewandte Behandlungen und Wachstumsstadien verursacht werden. Mykorrhiza-Detailkarten, die mit der MycoPatt-Methode gewonnen werden, sind nützlich für die Früherkennung der Pflanzeneffizienz bei der symbiotischen Aufnahme aus dem Boden.

Introduction

Arbuskuläre Mykorrhiza (AM) Pilze sind eine Kategorie von bodenbürtigen Endophyten, die für Forscher ständig von Interesse sind. Ihre Anwesenheit in den Wurzeln der meisten Pflanzen und ihre Beteiligung an Nährstoffkreisläufen machen sie zu lebenswichtigen Komponenten für die Stabilität jedes Ökosystems, in dem krautige Pflanzen vorhanden sind ^1,2. Durch ihr extraradikuläres Myzel wirken AM als Pilzverlängerung für Pflanzenwurzeln, insbesondere in schwer zugänglichen Bereichen³. Die Hauptaktivität liegt in den Wurzeln der Wirtspflanze, wo AM große Hyphennetzwerke und spezifische intrazelluläre Strukturen, die Arbuskeln genannt werden, entwickelt. Die fehlende Wirtsspezifität ermöglicht es dem Symbionten, mehrere Arten gleichzeitig zu besiedeln. Diese Fähigkeit verleiht AM die Rolle der Ressourcenallokation und Nährstoffregulierung im Ökosystem; Der Pilz unterstützt auch das Überleben der Pflanzen und hilft bei der Pflanzenleistung 4,5,6,7. Die Reaktion von AM-Spezies auf Wirtswurzeln ist in der Ausdehnung und Lage des intraradikulären Myzels und dem Vorhandensein und der Form der intrazellulär entwickelten Arbuskeln sichtbar. Die intrazellulären Arbuskeln fungieren als Austauschpunkt zwischen den beiden Symbionten und stellen Bereiche dar, die durch schnelle Transferprozesse gekennzeichnet sind. Die Strukturen, die die AM produzieren, sind artabhängig und entwickeln neben Arbuskeln in den Wurzeln auch Vesikel, Sporen und Hilfszellen.

Es gibt viele Herausforderungen bei der Beurteilung von AM-Symbionten in Pflanzenwurzeln ^8,9. Die erste ist ihre ständige Entwicklung während der gesamten Vegetationsperiode der Wirte, was zu mehreren Veränderungen in der hyphalen arbuskulären Struktur führt. Die verschiedenen Stadien des arbuskulären Wachstums bis zu ihrem Kollaps sind in den Wurzeln deutlich vorhanden, aber die seneszenten AM-Strukturen werden manchmal verdaut, was sie nur teilweise sichtbar macht¹⁰. Die zweite Herausforderung besteht in der Färbemethode und dem Protokoll, der großen Vielfalt der Wurzelsysteme, der Größe ihrer Zellen und den Unterschieden in der Dicke, die es schwierig machen, eine einheitliche Methode vorzuschlagen. Die letzte Herausforderung stellt die Bewertung und Bewertung der AM-Kolonisation dar. Es gibt zahlreiche Methoden, die AM mit unterschiedlicher Objektivität bewerten, und die meisten von ihnen sind immer noch auf Mikroskopietechniken beschränkt. Die einfachen basieren auf dem Vorhandensein / Fehlen von Strukturen im Wurzelkortex, während die komplexeren auf visuellem Scoring und der Verwendung von Kolonisationsklassen basieren, mit der Integration der Häufigkeit und Intensität des Kolonisationsphänomens. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Daten über den Mykorrhizastatus mehrerer Arten produziert, aber die meisten Methoden beschränken sich auf den beobachteten Wert der Besiedlung, ohne auf die tatsächliche Position jeder Struktur im Wurzelkortex hinzuweisen. Als Reaktion auf die Notwendigkeit genauerer Ergebnisse zur AM-Besiedlung wurde eine Methode entwickelt, die auf mikroskopischer Analyse von Mykorrhizamustern (MycoPatt) in Wurzeln basiert, um die detaillierten Mykorrhizakarten in digitaler Form zusammenzustellen¹¹. Die Methode ermöglicht auch die objektive Berechnung von Besiedlungsparametern und die Bestimmung der tatsächlichen Position jeder Struktur in der Wurzel.

Die Position der AM-Pilzstrukturen kann bei der Beantwortung der folgenden zwei Fragen wichtig sein. Die erste bezieht sich auf die Analyse der Besiedlung in einem bestimmten Moment aus dem Vegetationszyklus einer Pflanze. In diesem Zusammenhang ist es sehr nützlich, die Arbuskular-/Vesikelhäufigkeit zu beobachten, zu berichten, wie sie sich in der Wurzel befinden, und ein sehr klares Kolonisationsbild und Parameter zu liefern. Die zweite bezieht sich auf die Erkennung der Pilzstrategie und ihre Ausrichtung und sogar die Prognose ihrer zukünftigen Entwicklung. Eine Anwendung des MycoPatt kann für Pflanzen täglich, alle 2-3 Tage, wöchentlich oder während verschiedener Wachstumsstadien analysiert werden. In diesem Zusammenhang ist die Lage der Vesikel/Arbuskel wichtig, um den biologischen Mechanismus der AM-Besiedlung besser zu verstehen. Diese Parameter und Beobachtungen sind sehr nützlich, um die mathematischen Parameter zu ergänzen.

Das Ziel dieses Artikels ist es, die Fähigkeit des MycoPatt-Systems zu demonstrieren, das native AM-Pilzbesiedlungspotenzial und die Strategie in Zea mays (Mais) Wurzeln während verschiedener Entwicklungsstadien und in Festuca rubra (Rotschwingel) Wurzeln unter verschiedenen Langzeitbefruchtungsbedingungen zu erforschen. Um das Ziel zu erreichen, wurden zwei große Datenbanken aus zwei Experimenten analysiert. Das Maisexperiment wurde in Cojocna (46°44′56″ lat. N und 23°50′0″ lang) eingerichtet. E), in der experimentellen didaktischen Farm der Universität für Agrarwissenschaften und Veterinärmedizin Cluj auf einem Phäozom mit einer lehmigen Textur^{Erde 12}. Das Rotschwingelexperiment ist Teil eines größeren Versuchsgeländes, das 2001 in Ghețari, Apuseni-Gebirge (46°49’064″ lat. N und 22°81’418” lang) eingerichtet wurde. E), auf einem Präluvosol (terra rossa) Bodentyp^13,14. Mais wurde in fünf verschiedenen Wachstumsphänophasen^{gesammelt 12}: B1 = 2-4 Blätter (als Kontrollpunkt für den Beginn der Mykorrhizabesiedlung); B2 = 6 Blätter; B3 = 8-10 Blätter; B4 = Kolbenbildung; B5 = physiologische Reife. Ausgehend vom 2-4-Blatt-Stadium (A0) wurde eine organische Behandlung angewendet, die zu einem Zwei-Graduierungsfaktor führte (A1 = Kontrolle und A2 = behandelt). Wurzeln des Rotschwingels wurden bei der Blüte aus einem Versuch mit fünf Langzeitdüngungen gesammelt^13,14: V1 = Kontrolle^, nicht befruchtet; V2 = 10 t·^ha-1 Gülle; V3 = 10 t·ha-1 Gülle + N 50 kg·ha-1, P2O5 25kg·ha-1,_K2O25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1,_K2O50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 Gülle + N 100 kg·ha-1, P2O5 50kg·ha-1,_K2O50 kg·^ha-1. Aus jeder Düngungsvariante wurden in jeder Entwicklungsstufe fünf Pflanzen gesammelt. Die Färbeprotokolle und ihre Leistung in Bezug auf Probenverarbeitungszeit und Färbequalität wurden analysiert. Der Zusammenhang zwischen der Entwicklung von AM-Hyphen und dem Vorhandensein ihrer Strukturen in den Wurzeln wurde für jede Art separat analysiert und mit der Identifizierung der freizügigsten Wurzeln für die Besiedlung fortgesetzt. Die spezifischen Besiedlungsmuster jedes Wurzelsystems wurden basierend auf Kolonisationskarten und dem Wert der AM-Parameter analysiert.

Mais ist eine einjährige Pflanze, was ein kontinuierliches Wachstum der Wurzeln impliziert, und das war der Hauptgrund, den MycoPatt in den Wachstumsstadien anzuwenden. Rotschwingel ist eine mehrjährige Pflanze aus einem Grasland, das lange Zeit mit verschiedenen Düngemitteln behandelt wurde. Seine Wurzeln haben eine kürzere Entwicklung von 1 Jahr, und die Anthese gilt als Vegetationspunkt, wenn die Pflanze ihren Stoffwechsel von vegetativ zu generativ ändert. Um diese Pflanzen während dieser intensiven Aktivitätsperioden zu fangen, wurden die oben genannten Zeitpunkte gewählt. Die Probenahme während der Vegetationsperiode ist für diese Art schwierig, wenn sie in natürlichem Grasland angebaut wird.

Protocol

1. Auswahl des biologischen Materials, Wurzelprobenahme und Lagerung Sammeln Sie die gesamte Pflanzenwurzel mit einer Schaufel (Abbildung 1A) separat für jede Variante und replizieren Sie. Entfernen Sie vorsichtig von Hand die großen Bodenaggregate von den Wurzeln. Waschen Sie das gesamte Wurzelsystem und messen Sie es auf einer Skala mit 1 cm x 1 cm großen Zellen (Abbildung 1B). Schneiden Sie die Wurzeln für jede Pflanze separat u…

Representative Results

Die korrekte Anwendung der schonenden Zerkleinerungsmethode der Wurzeln nach den Färbevorgängen liefert gute Details der Mykorrhizastrukturen, sowohl für Zea mays (Abbildung 8A-C) als auch für Festuca rubra (Abbildung 9A-E), einen guten Kontrast zwischen Mykorrhizastrukturen und Wurzelzellen und eine Bestätigung der Stele aufgrund der blauen Farbe. Wenn die Reinigungs- und…

Discussion

Studien zur Mykorrhizabesiedlung sind entscheidend für die Entwicklung neuer Strategien im agronomischen Bereich. Das Potenzial mehrerer Kulturpflanzen, eine symbiotische Assoziation mit arbuskulären Mykorrhizen zu bilden, machte sie zu einem wichtigen Bestandteil der nachhaltigen Entwicklung des Agrarökosystems und der Erhaltung seiner Gesundheit 16,17,18,19,20.^…

Materials

Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb