Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados
Summary
La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza cerebral utilizando el método CLARITY permite la investigación de un gran número de neuronas y astrocitos simultáneamente.
Abstract
La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos utilizando el método CLARITY permite investigar simultáneamente varios tipos de células cerebrales y sus interacciones. La transducción de vectores virales permite el marcado de diversos tipos de células en diferentes colores de fluorescencia dentro del mismo tejido. Las células pueden ser identificadas genéticamente por actividad o proyección. Utilizando un protocolo CLARITY modificado, el tamaño potencial de la muestra de astrocitos y neuronas ha crecido en 2-3 órdenes de magnitud. El uso de CLARITY permite la obtención de imágenes de astrocitos completos, que son demasiado grandes para caber en su totalidad en rodajas, y el examen de los somata con todos sus procesos. Además, brinda la oportunidad de investigar la interacción espacial entre los astrocitos y los diferentes tipos de células neuronales, a saber, el número de neuronas piramidales en cada dominio astrocítico o la proximidad entre los astrocitos y las poblaciones específicas de neuronas inhibitorias. Este documento describe, en detalle, cómo se deben aplicar estos métodos.
Introduction
En los últimos años, el conocimiento de la función de los astrocitos y cómo interactúan con los circuitos neuronales ha aumentado dramáticamente. Los astrocitos pueden influir en la plasticidad 1,2, ayudar en la recuperación neuronal postinjuria 3,4 e incluso inducir la potenciación neuronal de novo, con estudios recientes que muestran la importancia de los astrocitos en la adquisición y recompensa de la memoria, anteriormente consideradas como funciones puramente neuronales 5,6,7 . Una característica de particular interés en la investigación de astrocitos es la disposición espacial de las células, que mantienen organizaciones espaciales únicas en el hipocampo y otras estructuras cerebrales 8,9,10. A diferencia de las dendritas neuronales que se entrelazan entre los somata celulares, los astrocitos del hipocampo habitan territorios visualmente distinguibles con ligera superposición entre sus procesos, creando dominios distintos 8,11,12,13. La evidencia que apoya la participación de los astrocitos en los circuitos neuronales no apoya la falta de una descripción anatómica detallada de tales poblaciones y las neuronas en sus dominios14.
Los procedimientos de transducción de vectores virales, junto con los animales transgénicos (TG), se han popularizado como un conjunto de herramientas para investigar las estructuras cerebrales, las funciones y las interacciones celulares15,16. La utilización de diferentes promotores permite la focalización de células específicas según sus propiedades genéticas, niveles de activación17,18 u objetivos de proyección. Diferentes virus pueden expresar fluoróforos de diferentes colores en diferentes poblaciones. Un virus se puede combinar con la expresión endógena de fluoróforos en TG, o se pueden usar animales TG sin la necesidad de virus. Estas técnicas son ampliamente utilizadas para el marcado neuronal, y algunos laboratorios han comenzado a utilizarlas con modificaciones especializadas para dirigirse a otros tipos de células, como los astrocitos 5,9,19.
La técnica CLARITY, descrita por primera vez en 201320,21, permite el estudio de rebanadas gruesas de cerebro al hacer que todo el cerebro sea transparente mientras deja intactas las estructuras microscópicas. Al combinar los dos métodos, la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos, ahora está disponible la opción de examinar las interacciones espaciales entre diferentes poblaciones de tipos celulares. La mayoría de los estudios de interacción astrocito-neurona se realizaron en rebanadas delgadas de cerebro, lo que resultó en imágenes de astrocitos incompletos debido a sus grandes dominios, lo que restringió radicalmente el número de células analizadas. El uso de la técnica CLARITY permite la caracterización de resolución de una sola célula de poblaciones celulares en volúmenes a gran escala simultáneamente. La obtención de imágenes de poblaciones celulares marcadas fluorescentemente en cerebros claros no proporciona resolución sináptica, pero permite una caracterización exhaustiva de las interacciones espaciales entre los astrocitos y una variedad de tipos de células neuronales.
Por esa razón, aprovechamos estas técnicas de vanguardia para investigar las propiedades de los astrocitos en todo el CA1 dorsal, obteniendo imágenes de toda la lámina (Estrato Radiatum, capa piramidal y Estrato Oriens). Medimos decenas de miles de astrocitos (con penetrancia viral de >96%5), analizando así la información de toda la población astrocítica alrededor de CA1. Con una penetrancia eficiente de los marcadores neuronales, pudimos registrar las interacciones entre toda la población de astrocitos CA1 y los cuatro tipos de células neuronales: parvalbúmina (PV), somatostatina (SST), neuronas inhibidoras VIP y células piramidales excitatorias9.
Se realizaron varios experimentos utilizando una combinación de fluorescencia de animales TG y vectores virales de diferentes colores (todas células inhibitorias), mientras que otros (excitatorios) utilizaron dos vectores virales que expresan diferentes fluoróforos bajo diferentes promotores9. Este artículo presenta un protocolo detallado, que incluye el etiquetado de las células deseadas en el cerebro, haciendo que el cerebro sea transparente utilizando un procedimiento CLARITY modificado, así como imágenes y análisis de estructuras cerebrales completas, utilizando varios procedimientos y software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos de limpieza de tejidos presentan una herramienta revolucionaria en la investigación del cerebro, invitando a preguntas que antes no se podrían haber hecho. A partir de apuntar a las propiedades de un pequeño grupo de células, una sola célula o incluso una sola sinapsis, CLARITY ahora permite la orientación de poblaciones celulares totales o características de conectividad de largo alcance mediante el uso de fluoróforos relevantes.
El resultado de la combinación de la expr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 803589), la Fundación de Ciencias de Israel (subvención ISF n.º 1815/18) y las subvenciones Canadá-Israel (CIHR-ISF, subvención n.º 2591/18). Agradecemos a Nechama Novick por comentar todo el manuscrito.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Riferimenti
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