Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato
Summary
La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.
Abstract
La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione dei tessuti utilizzando il metodo CLARITY consente di studiare contemporaneamente diversi tipi di cellule cerebrali e le loro interazioni. La trasduzione del vettore virale consente la marcatura di diversi tipi di cellule in diversi colori di fluorescenza all’interno dello stesso tessuto. Le cellule possono essere identificate geneticamente per attività o proiezione. Utilizzando un protocollo CLARITY modificato, la dimensione potenziale del campione di astrociti e neuroni è cresciuta di 2-3 ordini di grandezza. L’uso di CLARITY consente l’imaging di astrociti completi, che sono troppo grandi per adattarsi nella loro interezza a fette, e l’esame dei somata con tutti i loro processi. Inoltre, offre l’opportunità di studiare l’interazione spaziale tra astrociti e diversi tipi di cellule neuronali, vale a dire, il numero di neuroni piramidali in ciascun dominio astrocitico o la vicinanza tra astrociti e specifiche popolazioni di neuroni inibitori. Questo documento descrive, in dettaglio, come questi metodi devono essere applicati.
Introduction
Negli ultimi anni, la conoscenza della funzione degli astrociti e di come interagiscono con i circuiti neuronali è aumentata drasticamente. Gli astrociti possono influenzare la plasticità 1,2, aiutare nel recupero neuronale post-infortunio 3,4 e persino indurre un potenziamento neuronale de novo, con studi recenti che mostrano l’importanza degli astrociti nell’acquisizione e nella ricompensa della memoria, precedentemente considerate come funzioni puramente neuronali 5,6,7 . Una caratteristica di particolare interesse nella ricerca sugli astrociti è la disposizione spaziale delle cellule, che mantengono organizzazioni spaziali uniche nell’ippocampo e in altre strutture cerebrali 8,9,10. A differenza dei dendriti neuronali che si intrecciano tra i somata cellulari, gli astrociti ippocampali abitano territori visivamente distinguibili con una leggera sovrapposizione tra i loro processi, creando domini distinti 8,11,12,13. Le prove a sostegno della partecipazione degli astrociti nei circuiti neuronali non supportano la mancanza di una descrizione anatomica dettagliata di tali popolazioni e dei neuroni nei loro domini14.
Le procedure di trasduzione del vettore virale, insieme agli animali transgenici (TG), sono state rese popolari come set di strumenti per studiare le strutture cerebrali, le funzioni e le interazioni cellulari15,16. L’utilizzo di diversi promotori consente il targeting di cellule specifiche in base alle loro proprietà genetiche, ai livelli di attivazione17,18 o agli obiettivi di proiezione. Virus diversi possono esprimere fluorofori di colore diverso in diverse popolazioni. Un virus può essere combinato con l’espressione endogena di fluorofori in TG, oppure gli animali TG possono essere utilizzati senza la necessità di virus. Queste tecniche sono ampiamente utilizzate per la marcatura neuronale e alcuni laboratori hanno iniziato a utilizzarle con modifiche specializzate per il targeting di altri tipi di cellule, come gli astrociti 5,9,19.
La tecnica CLARITY, descritta per la prima volta nel 201320,21, consente lo studio di spesse fette di cervello rendendo trasparente l’intero cervello lasciando intatte le strutture microscopiche. Combinando i due metodi – trasduzione virale del vettore e pulizia dei tessuti – è ora disponibile l’opzione di esaminare le interazioni spaziali tra diverse popolazioni di tipi cellulari. La maggior parte degli studi di interazione astrociti-neuroni sono stati eseguiti su fette di cervello sottili, con conseguente immagine di astrociti incompleti a causa dei loro grandi domini, limitando così radicalmente il numero di cellule analizzate. L’uso della tecnica CLARITY consente la caratterizzazione simultanea della risoluzione di singole cellule di popolazioni cellulari in volumi su larga scala. L’imaging di popolazioni cellulari con tag fluorescenti in cervelli chiari non fornisce una risoluzione sinaptica, ma consente una caratterizzazione approfondita delle interazioni spaziali tra astrociti e una varietà di tipi di cellule neuronali.
Per questo motivo, abbiamo sfruttato queste tecniche all’avanguardia per studiare le proprietà degli astrociti in tutto il CA1 dorsale, immaginando tutte le lamina (Stratum Radiatum, strato piramidale e Stratum Oriens). Abbiamo misurato decine di migliaia di astrociti (con penetranza virale di >96%5), analizzando così le informazioni dell’intera popolazione astrocitica intorno a CA1. Con un’efficace penetranza dei marcatori neuronali, abbiamo potuto registrare le interazioni tra l’intera popolazione di astrociti CA1 e i quattro tipi di cellule neuronali: parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neuroni inibitori VIP e cellule piramidali eccitatorie9.
Diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una combinazione di fluorescenza da animali TG e vettori virali di colore diverso (tutte le cellule inibitorie), mentre altri (eccitatori) hanno utilizzato due vettori virali che esprimono diversi fluorofori sotto diversi promotori9. Questo documento presenta un protocollo dettagliato, che include l’etichettatura delle cellule desiderate nel cervello, rendendo il cervello trasparente utilizzando una procedura CLARITY modificata, nonché l’imaging e l’analisi di strutture cerebrali complete, utilizzando varie procedure e software.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi di compensazione dei tessuti rappresentano uno strumento rivoluzionario nella ricerca sul cervello, invitando a domande che in precedenza non avrebbero potuto essere poste. Dal targeting delle proprietà di un piccolo gruppo di cellule, una singola cellula o anche una singola sinapsi, CLARITY ora consente il targeting di popolazioni cellulari totali o funzionalità di connettività a lungo raggio utilizzando fluorofori pertinenti.
Il risultato dell’espressione del fluoroforo e della c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 803589), dalla Israel Science Foundation (sovvenzione ISF n. 1815/18) e dalle sovvenzioni Canada-Israele (CIHR-ISF, sovvenzione n. 2591/18). Ringraziamo Nechama Novick per aver commentato l’intero manoscritto.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Riferimenti
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