Étude de l’interaction spatiale entre les astrocytes et les neurones dans les cerveaux nettoyés
Summary
La combinaison de la transduction du vecteur viral et de l’élimination du cerveau à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément un grand nombre de neurones et d’astrocytes.
Abstract
La combinaison de la transduction des vecteurs viraux et de l’élimination des tissus à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément plusieurs types de cellules cérébrales et leurs interactions. La transduction de vecteurs viraux permet le marquage de divers types de cellules dans différentes couleurs de fluorescence dans le même tissu. Les cellules peuvent être identifiées génétiquement par activité ou projection. En utilisant un protocole CLARITY modifié, la taille potentielle de l’échantillon d’astrocytes et de neurones a augmenté de 2 à 3 ordres de grandeur. L’utilisation de CLARITY permet l’imagerie d’astrocytes complets, qui sont trop gros pour tenir dans leur intégralité en tranches, et l’examen des somata avec tous leurs processus. En outre, il offre la possibilité d’étudier l’interaction spatiale entre les astrocytes et différents types de cellules neuronales, à savoir le nombre de neurones pyramidaux dans chaque domaine astrocytaire ou la proximité entre les astrocytes et des populations spécifiques de neurones inhibiteurs. Ce document décrit, en détail, comment ces méthodes doivent être appliquées.
Introduction
Au cours des dernières années, la connaissance de la fonction des astrocytes et de la façon dont ils interagissent avec les circuits neuronaux a considérablement augmenté. Les astrocytes peuvent influencer la plasticité 1,2, aider à la récupération neuronale post-blessure 3,4, et même induire une potentialisation neuronale de novo, avec des études récentes montrant l’importance des astrocytes dans l’acquisition de la mémoire et la récompense, auparavant considérées comme des fonctions purement neuronales 5,6,7 . Une caractéristique particulièrement intéressante dans la recherche sur les astrocytes est la disposition spatiale des cellules, qui maintiennent des organisations spatiales uniques dans l’hippocampe et d’autres structures cérébrales 8,9,10. Contrairement aux dendrites neuronales qui s’entrelacent entre les somata cellulaires, les astrocytes de l’hippocampe habitent des territoires visuellement distinguables avec un léger chevauchement entre leurs processus, créant des domaines distincts 8,11,12,13. Les preuves soutenant la participation des astrocytes dans les circuits neuronaux ne soutiennent pas l’absence de description anatomique détaillée de ces populations et des neurones dans leurs domaines14.
Les procédures de transduction des vecteurs viraux, ainsi que les animaux transgéniques (TG), ont été popularisés comme un ensemble d’outils pour étudier les structures cérébrales, les fonctions et les interactions cellulaires15,16. L’utilisation de différents promoteurs permet de cibler des cellules spécifiques en fonction de leurs propriétés génétiques, de leurs niveaux d’activation17,18 ou de leurs cibles de projection. Différents virus peuvent exprimer des fluorophores de différentes couleurs dans différentes populations. Un virus peut être combiné avec l’expression endogène de fluorophores dans la TG, ou les animaux TG peuvent être utilisés sans avoir besoin de virus. Ces techniques sont largement utilisées pour le marquage neuronal, et certains laboratoires ont commencé à les utiliser avec des modifications spécialisées pour cibler d’autres types de cellules, telles que les astrocytes 5,9,19.
La technique CLARITY, décrite pour la première fois en 201320,21, permet d’étudier des tranches de cerveau épaisses en rendant l’ensemble du cerveau transparent tout en laissant les structures microscopiques intactes. En combinant les deux méthodes – transduction du vecteur viral et nettoyage des tissus – l’option d’examiner les interactions spatiales entre différentes populations de type cellulaire est maintenant disponible. La plupart des études d’interaction astrocyte-neurone ont été réalisées sur de fines tranches de cerveau, ce qui a donné lieu à des images d’astrocytes incomplets en raison de leurs grands domaines, limitant ainsi radicalement le nombre de cellules analysées. L’utilisation de la technique CLARITY permet de caractériser simultanément la résolution unicellulaire des populations cellulaires dans des volumes à grande échelle. L’imagerie de populations cellulaires marquées par fluorescence dans des cerveaux clairs n’offre pas de résolution synaptique, mais permet une caractérisation approfondie des interactions spatiales entre les astrocytes et une variété de types de cellules neuronales.
Pour cette raison, nous avons exploité ces techniques de pointe pour étudier les propriétés des astrocytes dans l’ensemble du CA1 dorsal, en imageant toutes les lames (Stratum Radiatum, couche pyramidale et Stratum Oriens). Nous avons mesuré des dizaines de milliers d’astrocytes (avec une pénétrance virale de >96%5), analysant ainsi l’information de l’ensemble de la population astrocytaire autour de CA1. Avec une pénétrance efficace des marqueurs neuronaux, nous avons pu enregistrer les interactions entre l’ensemble de la population d’astrocytes CA1 et les quatre types de cellules neuronales- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), neurones inhibiteurs VIP et cellules pyramidales excitatrices9.
Plusieurs expériences ont été réalisées en utilisant une combinaison de fluorescence d’animaux TG et de vecteurs viraux de couleurs différentes (toutes les cellules inhibitrices), tandis que d’autres (excitatrices) ont utilisé deux vecteurs viraux exprimant différents fluorophores sous différents promoteurs9. Cet article présente un protocole détaillé, y compris le marquage des cellules souhaitées dans le cerveau, rendant le cerveau transparent à l’aide d’une procédure CLARITY modifiée, ainsi que l’imagerie et l’analyse de structures cérébrales complètes, à l’aide de diverses procédures et logiciels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes de nettoyage des tissus présentent un outil révolutionnaire dans la recherche sur le cerveau, invitant à des questions qui n’auraient pas pu être posées auparavant. En ciblant les propriétés d’un petit groupe de cellules, d’une seule cellule ou même d’une seule synapse, CLARITY permet désormais de cibler des populations cellulaires totales ou des caractéristiques de connectivité à longue portée en utilisant des fluorophores pertinents.
Le résultat de l’exp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 803589), de la Fondation israélienne pour la science (subvention ISF n° 1815/18) et des subventions Canada-Israël (CIHR-ISF, subvention n° 2591/18). Nous remercions Nechama Novick d’avoir commenté l’ensemble du manuscrit.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Riferimenti
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