La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.
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Articolo metodologico
Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato
In questo articolo
Sommario
Abstract
La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione dei tessuti utilizzando il metodo CLARITY consente di studiare contemporaneamente diversi tipi di cellule cerebrali e le loro interazioni. La trasduzione del vettore virale consente la marcatura di diversi tipi di cellule in diversi colori di fluorescenza all'interno dello stesso tessuto. Le cellule possono essere identificate geneticamente per attività o proiezione. Utilizzando un protocollo CLARITY modificato, la dimensione potenziale del campione di astrociti e neuroni è cresciuta di 2-3 ordini di grandezza. L'uso di CLARITY consente l'imaging di astrociti completi, che sono troppo grandi per adattarsi nella loro interezza a fette, e l'esame dei somata con tutti i loro processi. Inoltre, offre l'opportunità di studiare l'interazione spaziale tra astrociti e diversi tipi di cellule neuronali, vale a dire, il numero di neuroni piramidali in ciascun dominio astrocitico o la vicinanza tra astrociti e specifiche popolazioni di neuroni inibitori. Questo documento descrive, in dettaglio, come questi metodi devono essere applicati.
Introduzione
Negli ultimi anni, la conoscenza della funzione degli astrociti e di come interagiscono con i circuiti neuronali è aumentata drasticamente. Gli astrociti possono influenzare la plasticità 1,2, aiutare nel recupero neuronale post-infortunio 3,4 e persino indurre un potenziamento neuronale de novo, con studi recenti che mostrano l'importanza degli astrociti nell'acquisizione e nella ricompensa della memoria, precedentemente considerate come funzioni puramente neuronali 5,6,7
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Protocollo
I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università ebraica e hanno soddisfatto le linee guida della Guida dell'Istituto Nazionale di Salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Trasduzione del vettore virale
NOTA: La trasduzione del vettore virale viene utilizzata per esprimere fluorofori nel cervello.
- Utilizzare un atlante (ad esempio, Allen Brain Atlas) per individuare il coordinamento pertinente dell'area target.
NOTA: gli atlanti 3D possono essere trovati online (ad esempio, http://connectivity.brain-map.o....
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Risultati
La corretta eliminazione di spesse fette di tessuto cerebrale si traduce in una nuova gamma di domande che possono essere poste riguardo alle proprietà di grandi popolazioni cellulari rispetto alle proprietà di singole cellule o gruppi vicini di cellule. Per ottenere risultati di successo, si dovrebbe rispettare rigorosamente il protocollo CLARITY, in quanto esiste una vasta gamma di parametri che devono essere considerati per ridurre la varianza tra i campioni (ad esempio, percentuale di chiarezza, informazioni sulla fl.......
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Discussione
I metodi di compensazione dei tessuti rappresentano uno strumento rivoluzionario nella ricerca sul cervello, invitando a domande che in precedenza non avrebbero potuto essere poste. Dal targeting delle proprietà di un piccolo gruppo di cellule, una singola cellula o anche una singola sinapsi, CLARITY ora consente il targeting di popolazioni cellulari totali o funzionalità di connettività a lungo raggio utilizzando fluorofori pertinenti.
Il risultato dell'espressione del fluoroforo e della comb.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 803589), dalla Israel Science Foundation (sovvenzione ISF n. 1815/18) e dalle sovvenzioni Canada-Israele (CIHR-ISF, sovvenzione n. 2591/18). Ringraziamo Nechama Novick per aver commentato l'intero manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vettore virale utilizzato per rilevare gli astrociti | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vettore virale utilizzato per rilevare i neuroni | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vettore virale utilizzato per rilevare i nuclei neuronali | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vettore virale utilizzato per rilevare i neuroni | |
| Acrilammide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrilammide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Acido borico | Sigma | #B7901 | Peso molecolare - 61,83 g/mol Microscopio |
| confocale, scansione, obiettivo FV1000 | Olympus | 4x (UPlanSApo, 0,16 NA) | |
| Software | ImarisBitplane, Regno Unito | Un software che consente l'analisi 3D delle immagini | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| Software | Un software che consente l'analisi 3D delle immagini utilizzando la realtà virtuale | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Peso molecolare - 121,14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Microscopio a due fotoni | Neurolabware | Laser Ti:sapphire (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubi fotomoltiplicatori GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro passa-banda (Semrock), obiettivo 16x ad immersione in acqua (Nikon, 0,8 NA) | |
| VA-044 Iniziatore | Wako | #011-19365 |
Riferimenti
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
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Ristampe e permessi
