חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים
Summary
שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.
Abstract
שילוב של התמרה וקטורית נגיפית ופינוי רקמות בשיטת CLARITY מאפשר לחקור בו-זמנית מספר סוגים של תאי מוח ואת האינטראקציות ביניהם. התמרה וקטורית נגיפית מאפשרת סימון של סוגי תאים מגוונים בצבעים פלואורסצנטיים שונים בתוך אותה רקמה. ניתן לזהות תאים מבחינה גנטית על ידי פעילות או הקרנה. באמצעות פרוטוקול CLARITY שונה, גודל המדגם הפוטנציאלי של אסטרוציטים ותאי עצב גדל ב-2-3 סדרי גודל. השימוש ב- CLARITY מאפשר הדמיה של אסטרוציטים שלמים, שהם גדולים מכדי להתאים לשלמותם בפרוסות, ובדיקת הסומטה עם כל התהליכים שלהם. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות לחקור את האינטראקציה המרחבית בין אסטרוציטים לסוגי תאים עצביים שונים, כלומר, מספר הנוירונים הפירמידליים בכל תחום אסטרוציטי או הקרבה בין אסטרוציטים לאוכלוסיות נוירונים מעכבות ספציפיות. מאמר זה מתאר, בפירוט, כיצד יש ליישם שיטות אלה.
Introduction
בשנים האחרונות, הידע על תפקוד האסטרוציטים וכיצד הם מתקשרים עם מעגלים עצביים גדל באופן דרמטי. אסטרוציטים יכולים להשפיע על פלסטיות 1,2, לסייע בהתאוששות עצבית לאחר הלידה 3,4, ואפילו לגרום לפוטנציה עצבית דה נובו, כאשר מחקרים אחרונים מראים את החשיבות של אסטרוציטים ברכישה ותגמול של זיכרון, שנחשבו בעבר לתפקודים עצביים גרידא 5,6,7 . מאפיין שמעניין במיוחד בחקר האסטרוציטים הוא הסידור המרחבי של התאים, השומרים על ארגונים מרחביים ייחודיים בהיפוקמפוס ובמבני מוח אחרים 8,9,10. שלא כמו הדנדריטים העצביים המשתלבים בין סומטה של התאים, אסטרוציטים בהיפוקמפוס מאכלסים טריטוריות הניתנות להבחנה חזותית עם חפיפה קלה בין התהליכים שלהם, ויוצרים תחומים נפרדים 8,11,12,13. הראיות התומכות בהשתתפותם של אסטרוציטים במעגלים עצביים אינן תומכות בהיעדר תיאור אנטומי מפורט של אוכלוסיות כאלה ושל תאי העצב בתחומם14.
הליכי התמרה וקטורית נגיפית, יחד עם בעלי חיים מהונדסים (TG), זכו לפופולריות כמערכת כלים לחקר מבנים מוחיים, תפקודים ואינטראקציות בין תאים15,16. השימוש במקדמים שונים מאפשר מיקוד של תאים ספציפיים על פי תכונותיהם הגנטיות, רמות ההפעלה17,18 או יעדי ההקרנה שלהם. וירוסים שונים יכולים לבטא פלואורופורים בצבעים שונים באוכלוסיות שונות. ניתן לשלב נגיף עם ביטוי אנדוגני של פלואורופורים ב- TG, או שניתן להשתמש בחיות TG ללא צורך בנגיפים. טכניקות אלה נמצאות בשימוש נרחב לסימון עצבי, וכמה מעבדות החלו להשתמש בהן עם שינויים המתמחים בהתמקדות בסוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים 5,9,19.
טכניקת CLARITY, שתוארה לראשונה בשנת 2013 20,21, מאפשרת לחקור פרוסות מוח עבות על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף תוך השארת המבנים המיקרוסקופיים שלמים. על ידי שילוב שתי השיטות – התמרה וקטורית נגיפית וניקוי רקמות – האפשרות לבחון את האינטראקציות המרחביות בין אוכלוסיות שונות של סוגי תאים זמינה כעת. רוב מחקרי האינטראקציה בין אסטרוציטים לנוירונים בוצעו על פרוסות מוח דקות, וכתוצאה מכך תמונות של אסטרוציטים לא שלמים בשל תחומיהם הגדולים, ובכך הגבילו באופן קיצוני את מספר התאים שנותחו. השימוש בטכניקת CLARITY מאפשר אפיון ברזולוציה של תא יחיד של אוכלוסיות תאים בכמויות גדולות בו-זמנית. הדמיה של אוכלוסיות תאים המתויגות באופן פלואורסצנטי במוחות צלולים אינה מספקת רזולוציה סינפטית, אלא מאפשרת אפיון יסודי של האינטראקציות המרחביות בין אסטרוציטים למגוון סוגי תאים עצביים.
מסיבה זו, רתמנו את הטכניקות המתקדמות האלה כדי לחקור את התכונות של אסטרוציטים לאורך CA1 הגבי, תוך הדמיה של כל הלמינה (Stratum Radiatum, שכבת הפירמידה ו-Stratum Oriens). מדדנו עשרות אלפי אסטרוציטים (עם חדירה נגיפית של >96%5), ובכך ניתחנו את המידע של כל האוכלוסייה האסטרוציטית סביב CA1. בעזרת חדירה יעילה של הסמנים העצביים, נוכל לתעד את האינטראקציות בין כל האוכלוסייה של אסטרוציטים CA1 לבין ארבעת הסוגים של תאים עצביים-פרוואלבומין (PV), סומטוסטטין (SST), נוירונים מעכבי VIP ותאים פירמידליים מעוררים9.
מספר ניסויים בוצעו באמצעות שילוב של פלואורסצנציה מחיות TG וווקטורים נגיפיים בצבעים שונים (כולם תאים מעכבים), בעוד שאחרים (מעוררים) השתמשו בשני וקטורים ויראליים המבטאים פלואורופורים שונים תחת מקדמים שונים9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט, הכולל תיוג של התאים הרצויים במוח, מה שהופך את המוח לשקוף באמצעות הליך CLARITY שונה, כמו גם הדמיה וניתוח של מבנים מוחיים שלמים, באמצעות נהלים ותוכנות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות לניקוי רקמות מהוות כלי מהפכני בחקר המוח, ומזמינות שאלות שלא ניתן היה לשאול קודם לכן. מהתמקדות בתכונות של קבוצה קטנה של תאים, תא בודד או אפילו סינפסה בודדת, CLARITY מאפשרת כעת מיקוד של אוכלוסיות תאים כוללות או תכונות קישוריות ארוכות טווח באמצעות פלואורופורים רלוונטיים.
הת?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס’ 803589), מהקרן הישראלית למדע (מענק ISF מס’ 1815/18) ומענקי קנדה-ישראל (CIHR-ISF, מענק מס’ 2591/18). אנו מודים לנחמה נוביק על ההערה על כתב היד כולו.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Riferimenti
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscienze. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
