Het bestuderen van Murine Small Bowel Mechanosensing van luminale deeltjes
Summary
Om te bestuderen hoe de dunne darm omgaat met deeltjes van verschillende groottes, hebben we een gevestigde in vivo methode aangepast om de doorvoer van de dunne darm te bepalen.
Abstract
Gastro-intestinale (GI) motiliteit is van cruciaal belang voor een normale spijsvertering en absorptie. In de dunne darm, die voedingsstoffen absorbeert, optimaliseert beweeglijkheid de spijsvertering en absorptie. Om deze reden omvatten sommige van de beweeglijkheidspatronen in de dunne darm segmentatie voor het mengen van luminale inhoud en peristaltiek voor hun voortstuwing. Fysische eigenschappen van luminale inhoud moduleren de patronen van dunne darmmotiliteit. De mechanische stimulatie van GI-mechanosensorische circuits door luminale inhoud en onderliggende darmmotiliteit initiëren en moduleren complexe GI-motorpatronen. Toch blijven de mechanosensorische mechanismen die dit proces aansturen slecht begrepen. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan hulpmiddelen om te ontleden hoe de dunne darm omgaat met materialen met verschillende fysieke eigenschappen. Om te bestuderen hoe de dunne darm omgaat met deeltjes van verschillende groottes, hebben we een gevestigde in vivo methode aangepast om de doorvoer van de dunne darm te bepalen. We vangen levende muizen met fluorescerende vloeistof of kleine fluorescerende kralen. Na 30 minuten ontleden we de darmen om de verdeling van fluorescerende inhoud over het hele maagdarmkanaal in beeld te brengen. Naast metingen met hoge resolutie van het geometrische centrum, gebruiken we binning van variabele grootte en spectrale analyse om te bepalen hoe verschillende materialen de doorvoer van de dunne darm beïnvloeden. We hebben onderzocht hoe een recent ontdekt “darmaanraking” -mechanisme de beweeglijkheid van de dunne darm beïnvloedt met behulp van deze aanpak.
Introduction
Het menselijke maagdarmkanaal (GI) is een orgaansysteem van meerdere meters lang, ruwweg benaderd als een buis van verschillende afmetingen en fysieke eigenschappen1. Naarmate de inhoud door de lengte beweegt, is de primaire functie van het maagdarmkanaal het absorberen van stoffen die van cruciaal belang zijn voor het leven. De dunne darm is specifiek verantwoordelijk voor de opname van voedingsstoffen. De transit van de dunne darm is strak gereguleerd om overeen te komen met de spijsvertering en absorptiefuncties, wat resulteert in verschillende beweeglijkheidspatronen. Bayliss en Starling beschreven de “wet van de darm”2 in 1899, met het contractiele voortstuwingsprogramma in de darm dat tegenwoordig bekend staat als de peristaltische reflex; het segment proximaal aan de voedselbolus trekt samen om het voort te stuwen, en het distale segment ontspant om het te ontvangen. In theorie zou dit patroon alleen al voldoende kunnen zijn om materiaal aboraal te transporteren, maar meer dan een eeuw onderzoek heeft een complexer beeld geschetst van contractiele activiteit in het maagdarmkanaal. Drie dunne darmmotiliteitsperioden worden bij mensen herkend: het migrerende motorische complex (MMC), de vastenperiode en de postprandiale periode3. Dezelfde patronen zijn gemeld bij muizen 4,5. De MMC is een cyclisch motorisch patroon dat bij de meeste zoogdieren bewaardblijft 6,7. Het MMC heeft een karakteristiek vierfasenpatroon dat dient als een nuttige klinische marker bij functionele GI-stoornissen7. De vier fasen, in volgorde van voorkomen, zijn (I) rust, (II) onregelmatige contracties met lage amplitude, (III) regelmatige contracties met hoge amplitude en (IV) ramp-down periode van afnemende activiteit7. De MMC markeert het belangrijkste motorische patroon van de vastenperiode3. MMC’s van de vastenperiode ruimen de inhoud van de dunne darm op ter voorbereiding op de volgende maaltijd.
De motorische patronen van de postprandiale periode zijn geoptimaliseerd voor de spijsverterings- en absorptiefuncties3. Ongeacht de calorische samenstelling, de eerste doorvoer is snel langs de dunne darm, de inhoud wordt verspreid over de lengte van de darm en de doorvoer vertraagt vervolgens8. De absorptie wordt geoptimaliseerd door het contactoppervlak te vergroten en te vertragen om de verblijftijd te verlengen. Zodra de voedingsstoffen zich in het lumen bevinden, bestaat het dominante patroon uit nauwe (<2 cm uit elkaar) ongecoördineerde contracties (segmenteringscontracties), met een paar over elkaar geplaatste contracten met grote amplitude over de hele lengte van de dunne darm (peristaltische contracties)9. Segmenterende contracties mengen de intraluminale inhoud op zijn plaats. De incidentele grote peristaltische samentrekkingen stuwen de inhoud naar de dikke darm.
De timing van deze overgang terug naar MMC’s hangt af van het voedselvolume en de calorische samenstelling10. De dunne darmmonsters geven dus luminale aanwijzingen om te regelen wanneer de overgang tussen motiliteitsperioden moet worden overgezet. Mechanische aanwijzingen, zoals fysische eigenschappen van luminale inhoud11, luminaal volume en wandspanning, betrekken mechanoreceptorcellen in de GI-wand 12,13,14,15,16. Inderdaad, het verhogen van de vaste component van een maaltijd leidt tot een toename van de dunne darmtransit17. We speculeren dat fysische eigenschappen, zoals de vloeibare of vaste toestand van intraluminale inhoud, verschillende mechanoreceptoren moeten aanspreken vanwege de verschillende krachten die ze genereren op de GI-wand18.
De gouden standaard voor het meten van in vivo GI-transit bij mensen, zoals bij muizen, is het gebruik van radioactieve tracers gemeten door scintigrafie als ze de maag verlaten of langs de dikke darm19,20. Bij zoogdieren loopt de dunne darm op onvoorspelbare manieren waardoor de dunne darm moeilijk in vivo betrouwbaar in beeld kan worden gebracht, maar er wordt vooruitgang geboekt21. Verder is er momenteel een gebrek aan hulpmiddelen om te kwantificeren hoe de dunne darm omgaat met deeltjes van verschillende eigenschappen en groottes. Het uitgangspunt hier was een gouden standaardtechniek die de studie van dunne darmtransit22,23,24 en barrièrefunctie22 standaardiseert. Het bestaat uit het verbijsteren van muizen met een fluorescerend materiaal, wachten op GI-beweeglijkheid om het materiaal te transporteren, het maagdarmkanaal uit te schakelen, het in verschillende secties van maag tot dikke darm te segmenteren, te sectieren en intraluminale inhoud te homogeniseren voor fluorescentiekwantificering. We hebben twee verbeteringen aangebracht. Ten eerste hebben we de samenstelling van de gegavaagde inhoud gewijzigd om fluorescerende microscopische kralen op te nemen om te bepalen hoe de dunne darm fysieke deeltjes verdeelt. Ten tweede hebben we de ruimtelijke resolutie verbeterd door het hele maagdarmkanaal van maag tot dikke darm ex vivo in beeld te brengen en binning van variabele grootte te gebruiken om onze analyse over dieren te standaardiseren. We stellen dat dit nieuwe inzichten onthult in de balans tussen propulsieve versus segmenterende contracties tijdens de postprandiale fase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het maagdarmkanaal vereist, net als andere buisvormige organen, zoals bloedvaten, mechanische sensoren en effectoren om de homeostase 26,27,28 te behouden. Het maagdarmkanaal is echter uniek omdat de fysieke eigenschappen van de materialen die het doorkruisen niet constant zijn tijdens maaltijden. Intraluminale inhoud van verschillende fysische eigenschappen (vast, vloeibaar en gas) passeert de darm en genereert verschillende me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken mevrouw Lyndsay Busby voor administratieve hulp en de heer Joel Pino voor de steun van de media. NIH-subsidies ondersteunden dit werk: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 en Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um – 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um – 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um – 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um – 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Riferimenti
- Stevens, C. E., Hume, I. D. . Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , (2004).
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
- Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
- Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
- Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
- Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
- Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
- Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
- Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
- Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
- Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
- Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
- Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
- Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
- Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
- McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
- Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
- Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
- Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
- Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
- Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
- Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
- Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
- Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
- Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes’ cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
- Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
- Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
- Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
- Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
- Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
- Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
- Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).
