Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale
Summary
Per studiare come l’intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell’intestino tenue.
Abstract
La motilità gastrointestinale (GI) è fondamentale per la normale digestione e assorbimento. Nell’intestino tenue, che assorbe i nutrienti, la motilità ottimizza la digestione e l’assorbimento. Per questo motivo, alcuni dei modelli di motilità nell’intestino tenue includono la segmentazione per la miscelazione dei contenuti luminali e la peristalsi per la loro propulsione. Le proprietà fisiche dei contenuti luminali modulano i modelli di motilità dell’intestino tenue. La stimolazione meccanica dei circuiti meccanosensoriali GI mediante il transito dei contenuti luminali e della motilità intestinale sottostante avvia e modula complessi schemi motori GI. Tuttavia, i meccanismi meccanosensoriali che guidano questo processo rimangono poco conosciuti. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti per sezionare come l’intestino tenue gestisce materiali di diverse proprietà fisiche. Per studiare come l’intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell’intestino tenue. Gavage topi vivi con liquido fluorescente o minuscole perline fluorescenti. Dopo 30 minuti, sezioniamo le viscere per visualizzare la distribuzione del contenuto fluorescente su tutto il tratto gastrointestinale. Oltre alle misurazioni ad alta risoluzione del centro geometrico, utilizziamo il binning di dimensioni variabili e l’analisi spettrale per determinare in che modo i diversi materiali influenzano il transito dell’intestino tenue. Abbiamo esplorato come un meccanismo di “tocco intestinale” recentemente scoperto influisce sulla motilità dell’intestino tenue usando questo approccio.
Introduction
Il tratto gastrointestinale umano (GI) è un sistema di organi lungo più piedi, approssimativamente approssimato come un tubo di varie dimensioni e proprietà fisiche1. Mentre il contenuto si muove attraverso la sua lunghezza, la funzione primaria del tratto gastrointestinale è quella di assorbire sostanze critiche per la vita. L’intestino tenue è specificamente responsabile dell’assorbimento dei nutrienti. Il transito dell’intestino tenue è strettamente regolato per abbinare le funzioni di digestione e assorbimento, con conseguente vari modelli di motilità. Bayliss e Starling descrissero la “legge dell’intestino”2 nel 1899, mostrando il programma di propulsione contrattile nell’intestino noto oggi come riflesso peristaltico; Il segmento prossimale al bolo alimentare si contrae per spingerlo in avanti e il segmento distale si rilassa per riceverlo. In teoria, questo modello da solo potrebbe essere sufficiente per trasportare materiale abortivamente, ma oltre un secolo di ricerca ha dipinto un quadro più complesso dell’attività contrattile nel tratto gastrointestinale. Nell’uomo sono riconosciuti tre periodi di motilità dell’intestino tenue: il complesso motorio migrante (MMC), il periodo di digiuno e il periodo postprandiale3. Gli stessi modelli sono stati riportati nei topi 4,5. La MMC è un modello motorio ciclico conservato nella maggior parte dei mammiferi 6,7. La MMC ha un caratteristico pattern a quattro fasi che funge da utile marcatore clinico nei disturbi gastrointestinali funzionali7. Le quattro fasi, in ordine di occorrenza, sono (I) quiescenza, (II) contrazioni irregolari a bassa ampiezza, (III) contrazioni regolari ad alta ampiezza e (IV) periodo di rampa dell’attività decrescente7. L’MMC segna il principale modello motorio del periodo di digiuno3. Le MMC del periodo di digiuno chiariscono il contenuto dell’intestino tenue in preparazione del pasto successivo.
I modelli motori del periodo postprandiale sono ottimizzati per le funzioni digestive e assorbenti3. Indipendentemente dalla composizione calorica, il transito iniziale è rapido lungo l’intestino tenue, il contenuto viene distribuito lungo la lunghezza dell’intestino e il transito successivamente rallenta8. L’assorbimento è ottimizzato aumentando la superficie di contatto e rallentandola per aumentare il tempo di permanenza. Una volta che i nutrienti sono all’interno del lume, il modello dominante consiste in contrazioni ravvicinate (<2 cm di distanza) non coordinate (contrazioni segmentanti), con alcune contrazioni sovrapposte di grande ampiezza che coprono l'intera lunghezza dell'intestino tenue (contrazioni peristaltiche)9. Le contrazioni segmentanti mescolano i contenuti intraluminali in posizione. Le occasionali grandi contrazioni peristaltiche spingono il contenuto verso il colon.
La tempistica di questa transizione verso MMC dipende dal volume del cibo e dalla composizione calorica10. Pertanto, l’intestino tenue campiona segnali luminali per regolare quando passare tra i periodi di motilità. I segnali meccanici, come le proprietà fisiche del contenuto luminale11, il volume luminale e la tensione della parete, impegnano le cellule meccanorecettrici nella parete GI 12,13,14,15,16. Infatti, aumentare la componente solida di un pasto porta ad un aumento del transito dell’intestino tenue17. Ipotizziamo che le proprietà fisiche, come lo stato liquido o solido dei contenuti intraluminali, debbano impegnare diversi meccanorecettori a causa delle varie forze che generano sulla parete GI18.
Il gold standard per misurare il transito GI in vivo nell’uomo, come nei topi, è l’uso di traccianti radioattivi misurati mediante scintigrafia mentre escono dallo stomaco o transitano lungo il colon19,20. Nei mammiferi, l’intestino tenue si muove in modi imprevedibili rendendo l’intestino tenue difficile da visualizzare in vivo in modo affidabile, ma si stanno facendo progressi21. Inoltre, attualmente mancano strumenti per quantificare come l’intestino tenue gestisce particolati di varie proprietà e dimensioni. Il punto di partenza qui è stata una tecnica gold standard che standardizza lo studio del transito dell’intestino tenue 22,23,24 e della funzione barriera 22. Consiste nel gavagare topi con un materiale fluorescente, in attesa della motilità gastrointestinale per trasportare il materiale, asportando il tratto gastrointestinale, segmentandolo in diverse sezioni dallo stomaco al colon, sezionando e omogeneizzando il contenuto intraluminale per la quantificazione della fluorescenza. Abbiamo apportato due miglioramenti. In primo luogo, abbiamo modificato la composizione del contenuto gavaged per includere perline microscopiche fluorescenti per determinare come l’intestino tenue distribuisce il particolato fisico. In secondo luogo, abbiamo migliorato la risoluzione spaziale visualizzando l’intero tratto gastrointestinale dallo stomaco al colon ex vivo e abbiamo utilizzato il binning di dimensioni variabili per standardizzare la nostra analisi tra gli animali. Ipotizziamo che questo riveli nuove intuizioni sull’equilibrio delle contrazioni propulsive rispetto a quelle segmentanti durante la fase postprandiale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tratto gastrointestinale, come altri organi tubulari, come i vasi sanguigni, richiede sensori meccanici ed effettori per mantenere l’omeostasi26,27,28. Tuttavia, il tratto gastrointestinale è unico in quanto le proprietà fisiche dei materiali che lo attraversano non sono costanti tra i pasti. Contenuti intraluminali di varie proprietà fisiche (solido, liquido e gas) transitano nell’intestino, generando diversi input meccan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Lyndsay Busby per l’assistenza amministrativa e il signor Joel Pino per il supporto dei media. Le sovvenzioni NIH hanno sostenuto questo lavoro: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 e Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um – 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um – 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um – 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um – 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Riferimenti
- Stevens, C. E., Hume, I. D. . Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , (2004).
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
- Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
- Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
- Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
- Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
- Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
- Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
- Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
- Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
- Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
- Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
- Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
- Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
- Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
- McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
- Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
- Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
- Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
- Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
- Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
- Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
- Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
- Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
- Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes’ cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
- Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
- Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
- Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
- Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
- Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
- Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
- Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).
