Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm
Summary
Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert.
Abstract
Die gastrointestinale Motilität (GI) ist entscheidend für eine normale Verdauung und Resorption. Im Dünndarm, der Nährstoffe aufnimmt, optimiert die Motilität die Verdauung und Absorption. Aus diesem Grund umfassen einige der Motilitätsmuster im Dünndarm Segmentierung zum Mischen von luminalen Inhalten und Peristaltik für ihren Antrieb. Physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts modulieren die Muster der Dünndarmmotilität. Die mechanische Stimulation mechanosensorischer GI-Schaltkreise durch den Transit von luminalen Inhalten und der zugrunde liegenden Darmmotilität initiiert und moduliert komplexe GI-Motormuster. Die mechanosensorischen Mechanismen, die diesen Prozess antreiben, sind jedoch noch wenig verstanden. Dies ist vor allem auf einen Mangel an Werkzeugen zurückzuführen, um zu analysieren, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht. Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert. Wir gördern lebende Mäuse mit fluoreszierender Flüssigkeit oder winzigen fluoreszierenden Perlen. Nach 30 Minuten sezieren wir den Darm, um die Verteilung des fluoreszierenden Inhalts über den gesamten GI-Trakt abzubilden. Zusätzlich zu hochauflösenden Messungen des geometrischen Zentrums verwenden wir Binning variabler Größe und Spektralanalysen, um zu bestimmen, wie verschiedene Materialien den Dünndarmtransit beeinflussen. Wir haben untersucht, wie ein kürzlich entdeckter “Darmberührungsmechanismus” die Dünndarmmotilität mit diesem Ansatz beeinflusst.
Introduction
Der menschliche Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein mehrere Fuß langes Organsystem, grob angenähert als Röhre mit unterschiedlichen Abmessungen und physikalischen Eigenschaften1. Während sich der Inhalt durch seine Länge bewegt, besteht die Hauptfunktion des Magen-Darm-Trakts darin, lebenswichtige Substanzen aufzunehmen. Der Dünndarm ist speziell für die Nährstoffaufnahme verantwortlich. Der Transit des Dünndarms ist streng reguliert, um den Verdauungs- und Absorptionsfunktionen zu entsprechen, was zu verschiedenen Motilitätsmustern führt. Bayliss und Starling beschrieben 1899 das “Gesetz des Darms”2 und zeigten das kontraktile Antriebsprogramm im Darm, das heute als peristaltischer Reflex bekannt ist; Das Segment in der Nähe des Nahrungsbolus zieht sich zusammen, um es vorwärts zu treiben, und das distale Segment entspannt sich, um es zu empfangen. Theoretisch könnte dieses Muster allein ausreichen, um Material aboral zu transportieren, aber über ein Jahrhundert Forschung hat ein komplexeres Bild der kontraktilen Aktivität im Magen-Darm-Trakt gezeichnet. Beim Menschen werden drei Dünndarmmotilitätsperioden erkannt: der wandernde motorische Komplex (MMC), die Fastenperiode und die postprandiale Periode3. Die gleichen Muster wurden bei Mäusenberichtet 4,5. Die MMC ist ein zyklisches motorisches Muster, das bei den meisten Säugetieren erhalten bleibt 6,7. Die MMC hat ein charakteristisches Vier-Phasen-Muster, das als nützlicher klinischer Marker bei funktionellen GI-Störungen dient7. Die vier Phasen, in der Reihenfolge ihres Auftretens, sind (I) Ruhe, (II) unregelmäßige, niedrige Amplitudenkontraktionen, (III) regelmäßige Kontraktionen mit hoher Amplitude und (IV) Ramp-down-Periode abnehmender Aktivität7. Die MMC markiert das wichtigste motorische Muster der Fastenperiode3. MMCs der Fastenzeit klären den Inhalt des Dünndarms in Vorbereitung auf die nächste Mahlzeit.
Die motorischen Muster der postprandialen Periode sind für die Verdauungs- und Absorptionsfunktionen optimiert3. Unabhängig von der kalorischen Zusammensetzung ist der anfängliche Transit schnell entlang des Dünndarms, der Inhalt wird entlang der Länge des Darms verteilt und der Transit verlangsamt sich anschließend8. Die Absorption wird optimiert, indem die Kontaktfläche vergrößert und verlangsamt wird, um die Verweilzeit zu verlängern. Sobald sich die Nährstoffe im Lumen befinden, besteht das dominante Muster aus engen (<2 cm auseinander) unkoordinierten Kontraktionen (segmentierende Kontraktionen), mit einigen überlagerten Kontraktionen mit großer Amplitude, die sich über die gesamte Länge des Dünndarms erstrecken (peristaltische Kontraktionen)9. Segmentierende Kontraktionen mischen die intraluminalen Inhalte an Ort und Stelle. Die gelegentlichen großen peristaltischen Kontraktionen treiben den Inhalt in Richtung Dickdarm.
Der Zeitpunkt dieses Übergangs zurück zu MMCs hängt vom Nahrungsvolumen und der Kalorienzusammensetzung ab10. So probiert der Dünndarm luminale Hinweise, um zu regulieren, wann zwischen den Motilitätsperioden übergegangen werden soll. Mechanische Hinweise, wie physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts11, des luminalen Volumens und der Wandspannung, greifen Mechanorezeptorzellen in der GI-Wand 12,13,14,15,16 ein. In der Tat führt die Erhöhung der festen Komponente einer Mahlzeit zu einer Zunahme des Dünndarmtransits17. Wir spekulieren, dass physikalische Eigenschaften, wie der flüssige oder feste Zustand von intraluminalen Inhalten, aufgrund der verschiedenen Kräfte, die sie an der GI-Wand erzeugen, verschiedene Mechanorezeptoren aktivieren müssen18.
Der Goldstandard für die Messung des In-vivo-GI-Transits beim Menschen wie bei Mäusen ist die Verwendung radioaktiver Tracer, die durch Szintigraphie gemessen werden, wenn sie den Magen verlassen oder entlang des Dickdarms19,20 gelangen. Bei Säugetieren schlingt sich der Dünndarm auf unvorhersehbare Weise, so dass der Dünndarm in vivo schwer zuverlässig abgebildet werden kann, aber es werden Fortschritte erzielt21. Darüber hinaus fehlen derzeit Werkzeuge, um zu quantifizieren, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Eigenschaften und Größen umgeht. Ausgangspunkt war hier eine Goldstandardtechnik, die die Untersuchung des Dünndarmtransits 22,23,24 und der Barrierefunktion 22 standardisiert. Es besteht darin, Mäuse mit einem fluoreszierenden Material zu glätten, auf die GI-Motilität zu warten, um das Material zu transportieren, den GI-Trakt zu entfernen, ihn in mehrere Abschnitte vom Magen zum Dickdarm zu segmentieren, intraluminale Inhalte zur Fluoreszenzquantifizierung zu schneiden und zu homogenisieren. Wir haben zwei Verbesserungen vorgenommen. Zuerst änderten wir die Zusammensetzung des gavaged Inhalts, um fluoreszierende mikroskopische Perlen einzubeziehen, um zu bestimmen, wie der Dünndarm physikalische Partikel verteilt. Zweitens verbesserten wir die räumliche Auflösung, indem wir den gesamten GI-Trakt vom Magen bis zum Dickdarm ex vivo abbildeten und Binning variabler Größe verwendeten, um unsere Analyse über Tiere hinweg zu standardisieren. Wir postulieren, dass dies neue Einblicke in das Gleichgewicht von propulsiven versus segmentierenden Kontraktionen während der postprandialen Phase liefert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Magen-Darm-Trakt benötigt wie andere röhrenförmige Organe wie Blutgefäße mechanische Sensoren und Effektoren, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 26,27,28. Der GI-Trakt ist jedoch insofern einzigartig, als die physikalischen Eigenschaften der Materialien, die ihn durchqueren, über die Mahlzeiten hinweg nicht konstant sind. Intraluminale Gehalte verschiedener physikalischer Eigenschaften (fest, flüssig und gasförmig)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Lyndsay Busby für die administrative Unterstützung und Herrn Joel Pino für die Unterstützung durch die Medien. NIH-Zuschüsse unterstützten diese Arbeit: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 und Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um – 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um – 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um – 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um – 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Riferimenti
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