Protokoll för att utveckla en lårbensosteotomimodell hos Wistar Albino-råttor

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att iatrogent bryta axeln på lårbenet hos Wistar albino råttor och följa upp utvecklingen av callus. Denna osteotomimodell för lårben kan hjälpa forskare att utvärdera processen för frakturläkning och att studera hur ett läkemedel kan påverka frakturläkning.

Abstract

Frakturläkning är en fysiologisk process som resulterar i regenerering av bendefekter genom samordnad verkan av osteoblaster och osteoklaster. Osteoanabola läkemedel har potential att öka reparationen av frakturer men har begränsningar som höga kostnader eller oönskade biverkningar. Benläkningspotentialen hos ett läkemedel kan initialt bestämmas genom in vitro-studier , men in vivo-studier behövs för det slutliga beviset på konceptet. Vårt mål var att utveckla en lårben osteotomi gnagare modell som kan hjälpa forskare att förstå utvecklingen av kallusbildning efter fraktur av lårbenets axel och som kan hjälpa till att fastställa om ett potentiellt läkemedel har benläkande egenskaper. Vuxna manliga Wistar albino råttor användes efter godkännande av institutionella djurförsöksetiska kommittén. Gnagarna bedövades, och under aseptiska förhållanden skapades fullständiga tvärgående frakturer i mitten en tredjedel av lårbenens axlar med öppen osteotomi. Frakturerna reducerades och fixerades internt med hjälp av intramedullära K-trådar, och sekundär frakturläkning tilläts ske. Efter operationen gavs intraperitoneala analgetika och antibiotika i 5 dagar. Sekventiell röntgen varje vecka bedömde kallusbildning. Råttorna offrades baserat på radiologiskt förutbestämda tidpunkter, och utvecklingen av frakturkallusen analyserades radiologiskt och med hjälp av immunohistokemi.

Introduction

Ben är en tät bindväv som består av benbildande celler, osteoblasterna och benresorberande celler, osteoklasterna. Frakturläkning är en fysiologisk process som resulterar i regenerering av bendefekter genom samordnad verkan av osteoblaster och osteoklaster¹. När det finns en fraktur är osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet vid frakturstället några av de viktiga faktorer som bestämmer benläkning². När frakturläkning avviker från sin normala kurs resulterar det i en försenad union, malunion eller nonunion. En fraktur sägs vara i icke-förening när det finns ett misslyckande av förening av frakturen i 9 månader, utan någon utveckling av reparation under de senaste 3 månaderna³. Cirka 10%-15% av alla frakturer upplever en fördröjning i reparationen som kan utvecklas till nonunion⁴. Nonunionfrekvensen för alla frakturer är 5% -10% och varierar beroende på benet som är involverat och platsen för fraktur⁵.

Den nuvarande behandlingen för behandling av frakturförening omfattar kirurgiska och / eller medicinska metoder. För närvarande kan fördröjd eller icke-förening av frakturer övervinnas genom kirurgiska strategier som bentransplantation. Bentransplantation har dock sina begränsningar och komplikationer som tillgänglighet av transplantatvävnad, smärta vid donatorplatsen, sjuklighet och infektion⁶. Medicinsk behandling omfattar osteoanabola läkemedel som benmorfogenetiskt protein (BMP) och teriparatid (parathormonanalog). För närvarande används osteoanabola agenter har potential att öka reparationen av frakturer men har begränsningar som orimliga kostnader eller oönskade biverkningar⁷. Därför finns det utrymme för att identifiera kostnadseffektiva, icke-kirurgiska alternativ för benläkning. Benläkningspotentialen hos ett läkemedel kan initialt bestämmas genom in vitro-studier , men in vivo-studier behövs för det slutliga beviset på konceptet. Ett läkemedel som är känt för att förbättra benläkning bör utvärderas in vitro och, om det visar sig lovande, kan användas för in vivo djurmodellstudier. Om läkemedlet visar sig främja benbildning och ombyggnad i in vivo-modellen kan det gå vidare till nästa steg (dvs. kliniska prövningar).

Att bedöma frakturläkning hos djur är ett logiskt steg framåt för att utvärdera ett nytt medel som introducerats för benläkning innan det genomgår mänskliga försök. För in vivo djurmodellstudier av frakturläkning har gnagare blivit en allt populärare modell⁸. Gnagarmodellerna har genererat ökande intresse på grund av de låga driftskostnaderna, det begränsade behovet av utrymme och mindre tid som behövs för benläkning⁹. Dessutom har gnagare ett brett spektrum av antikroppar och genmål, vilket möjliggör studier av de molekylära mekanismerna för benläkning och regenerering¹⁰. Ett konsensusmöte belyste omfattande olika benläkningsmodeller för smådjur och fokuserade på de olika parametrar som påverkar benläkning, samt betonade flera smådjursfrakturmodeller och implantat¹¹.

Grundläggande sprickmodeller kan i stort sett delas in i öppna eller slutna modeller. Slutna frakturmodeller använder en tre- eller fyrpunkts böjkraft på benet och kräver inte ett konventionellt kirurgiskt tillvägagångssätt. De leder till sneda eller spiralfrakturer, som liknar långa benfrakturer hos människor, men bristen på standardisering av frakturplats och dimensioner kan fungera som en förvirrande faktor i dem¹². Öppna frakturmodeller kräver kirurgisk åtkomst för benets osteotomi, hjälper till att uppnå ett mer konsekvent frakturmönster vid frakturstället, men är förknippade med fördröjd läkning jämfört med de slutna modellerna¹³. Valet av ben som används för att studera frakturläkning förblir huvudsakligen tibia och lårben på grund av deras dimensioner och tillgänglighet. Valet av platsen för fraktur är vanligtvis diafys eller metafys. Den metafysala regionen är speciellt vald i fall där frakturläkning studeras hos osteoporotiska ämnen, eftersom metafysen påverkas mer av osteoporos¹⁴. Flera implantat som intramedullära stift och externa fixatorer kan användas för att stabilisera frakturen^11,15.

Målet med denna studie var att utveckla en enkel och lätt att följa gnagarmodell som kunde hjälpa forskare att inte bara förstå utvecklingen av kallus efter lårbenets fraktur utan kan hjälpa till att avgöra om ett potentiellt läkemedel har benläkande egenskaper genom att förstå mekanismen genom vilken det verkar.

Protocol

Djurförsök gjordes efter etiskt godkännande från Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, New Delhi, Indien (286/IAEC-1/2021). 1. Preoperativt förfarande Hushane Wistar albino råttor 6-8 veckors ålder, väger mellan 150-200 g vardera, på en Central Animal Facility (CAF) i separata individuella burar. Detta säkerställer ingen kirurgisk / frakturskada när flera råttor delar burar. Håll råttorna vid en temperatur på 23 °C ± 2 °C i…

Representative Results

Denna studie genomfördes för att utveckla en lårben osteotomimodell i Wistar albino råttor. Denna modell kan användas för att utvärdera benläkning, liksom den osteogena effekten av ett lovande osteoanaboliskt läkemedel vid benläkning. Standard kirurgiska försiktighetsåtgärder och protokoll följdes. Sterila klänningar, draperier och kirurgisk utrustning användes för proceduren (figur 1). Utrustningen (tabell 1) steriliserades 48 timmar före operationen. Bed?…

Discussion

Denna metod beskriver tydligt de detaljer som behövs för att utveckla en fraktur osteotomi modell i Wistar albino råttor. Denna modell kan användas för att utvärdera den osteogena effekten av ett lovande osteoanaboliskt läkemedel vid frakturläkning, samt förstå komplikationerna med benläkning. Det framträdande med denna metod är att den är enkel och inte behöver för mycket tid eller sofistikerad utrustning. I denna metod valdes vuxna manliga Wistar-albinoråttor som gnagarmodell för experimenten. Enhetli…

Materials

Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2