Protocolo para el desarrollo de un modelo de osteotomía de fémur en ratas albinas Wistar

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para fracturar iatrogénicamente el eje del fémur de ratas albinas Wistar y hacer un seguimiento del desarrollo del callo. Este modelo de osteotomía de fémur puede ayudar a los investigadores a evaluar el proceso de curación de fracturas y a estudiar cómo un medicamento podría influir en la curación de fracturas.

Abstract

La curación de fracturas es un proceso fisiológico que resulta en la regeneración de defectos óseos por la acción coordinada de osteoblastos y osteoclastos. Los fármacos osteoanabólicos tienen el potencial de aumentar la reparación de fracturas, pero tienen limitaciones como altos costos o efectos secundarios indeseables. El potencial de curación ósea de un fármaco puede determinarse inicialmente mediante estudios in vitro , pero se necesitan estudios in vivo para la prueba final de concepto. Nuestro objetivo era desarrollar un modelo de roedor con osteotomía de fémur que pudiera ayudar a los investigadores a comprender el desarrollo de la formación de callos después de la fractura del eje del fémur y que pudiera ayudar a establecer si un fármaco potencial tiene propiedades curativas óseas. Se utilizaron ratas albinas Wistar macho adultas después de la autorización del Comité Institucional de Ética Animal. Los roedores fueron anestesiados y, en condiciones asépticas, se crearon fracturas transversales completas en el tercio medio de los ejes de los fémures mediante osteotomía abierta. Las fracturas se redujeron y se fijaron internamente utilizando cables K intramedulares, y se permitió la curación secundaria de la fractura. Después de la cirugía, se administraron analgésicos intraperitoneales y antibióticos durante 5 días. Las radiografías semanales secuenciales evaluaron la formación de callos. Las ratas fueron sacrificadas en base a puntos de tiempo predeterminados radiológicamente, y el desarrollo del callo de fractura se analizó radiológicamente y utilizando inmunohistoquímica.

Introduction

El hueso es un tejido conectivo denso que consiste en células formadoras de hueso, los osteoblastos y las células de reabsorción ósea, los osteoclastos. La curación de fracturas es un proceso fisiológico que resulta en la regeneración de defectos óseos por la acción coordinada de osteoblastos y osteoclastos¹. Cuando hay una fractura, la actividad osteoblástica y osteoclástica en el sitio de la fractura son algunos de los factores importantes que determinan la cicatrización ósea². Cuando la curación de la fractura se desvía de su curso normal, resulta en una unión retrasada, mala unión o falta de unión. Se dice que una fractura está en falta de unión cuando hay una falla de unión de la fractura durante 9 meses, sin progresión de reparación en los últimos 3 meses³. Aproximadamente el 10% -15% de todas las fracturas experimentan un retraso en la reparación que puede progresar a falta de unión⁴. La tasa de no unión para todas las fracturas es del 5% al 10% y varía según el hueso involucrado y el sitio de la fractura⁵.

El régimen actual para el tratamiento de la falta de unión de fracturas comprende modalidades quirúrgicas y/o médicas. Actualmente, el retraso o la no unión de las fracturas pueden superarse mediante estrategias quirúrgicas como el injerto óseo. Sin embargo, el injerto óseo tiene sus limitaciones y complicaciones como la disponibilidad de tejido del injerto, el dolor en el sitio donante, la morbilidad y la infección⁶. El tratamiento médico comprende fármacos osteoanabólicos como la proteína morfogenética ósea (BMP) y la teriparatida (análogo de la parathormona). Los agentes osteoanabólicos utilizados actualmente tienen el potencial de aumentar la reparación de fracturas, pero tienen limitaciones como costos exorbitantes o efectos secundarios indeseables⁷. Por lo tanto, hay margen para identificar alternativas rentables y no quirúrgicas para la curación ósea. El potencial de curación ósea de un fármaco puede determinarse inicialmente mediante estudios in vitro , pero se necesitan estudios in vivo para la prueba final de concepto. Un fármaco que se sabe que mejora la curación ósea debe evaluarse in vitro y, si se encuentra prometedor, puede usarse para estudios de modelos animales in vivo . Si el fármaco demuestra promover la formación y remodelación ósea en el modelo in vivo , podría pasar a la siguiente etapa (es decir, ensayos clínicos).

Evaluar la curación de fracturas en animales es un paso lógico para evaluar un nuevo agente introducido para la curación ósea antes de que se someta a ensayos en humanos. Para los estudios in vivo con modelos animales de curación de fracturas, los roedores se han convertido en un modelo cada vez más popular⁸. Los modelos de roedores han generado un creciente interés debido a los bajos costos operativos, la necesidad limitada de espacio y el menor tiempo necesario para la curación ósea⁹. Además, los roedores tienen un amplio espectro de anticuerpos y dianas genéticas, que permiten estudios sobre los mecanismos moleculares de curación y regeneración ósea¹⁰. Una reunión de consenso destacó exhaustivamente varios modelos de curación ósea de animales pequeños y se centró en los diferentes parámetros que influyen en la cicatrización ósea, así como en varios modelos e implantes de fracturas de animales pequeños¹¹.

Los modelos básicos de fractura se pueden dividir ampliamente en modelos abiertos o cerrados. Los modelos de fractura cerrada utilizan una fuerza de flexión de tres o cuatro puntos en el hueso y no requieren un enfoque quirúrgico convencional. Conducen a fracturas oblicuas o espirales, parecidas a las fracturas de huesos largos en humanos, pero la falta de estandarización de la ubicación y las dimensiones de la fractura puede actuar como un factor de confusión en ellas¹². Los modelos de fractura abierta requieren acceso quirúrgico para la osteotomía del hueso, ayudan a lograr un patrón de fractura más consistente en el sitio de la fractura, pero se asocian con retraso en la cicatrización en comparación con los modelos cerrados¹³. La elección del hueso utilizado para estudiar la curación de fracturas sigue siendo principalmente la tibia y el fémur debido a sus dimensiones y accesibilidad. La elección del sitio de fractura suele ser la diáfisis o metáfisis. La región metafisaria es especialmente elegida en los casos en que la curación de fracturas es estudiada en sujetos osteoporóticos, ya que la metáfisis está más afectada por la osteoporosis¹⁴. Se pueden utilizar varios implantes como clavos intramedulares y fijadores externos para estabilizar la fractura^11,15.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo de roedor simple y fácil de seguir que podría ayudar a los investigadores no solo a comprender el desarrollo del callo después de la fractura del fémur, sino que también podría ayudar a determinar si un medicamento potencial tiene propiedades de curación ósea al comprender el mecanismo por el cual actúa.

Protocol

Los experimentos con animales se realizaron después de obtener la aprobación ética del Comité Institucional de Ética Animal (AIEC), AIIMS, Nueva Delhi, India (286 / IAEC-1 / 2021). 1. Procedimiento preoperatorio Ratas albinas Wistar macho doméstico de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de entre 150 y 200 g cada una, en una Instalación Central de Animales (CAF) en jaulas individuales separadas. Esto asegura que no haya lesiones quirúrgicas / fracturas cuando v…

Representative Results

Este estudio se llevó a cabo para desarrollar un modelo de osteotomía de fémur en ratas albinas Wistar. Este modelo se puede utilizar para evaluar la curación ósea, así como el efecto osteogénico de un fármaco osteoanabólico prometedor en la curación ósea. Se siguieron las precauciones y protocolos quirúrgicos estándar. Para el procedimiento se utilizaron batas estériles, cortinas y equipo quirúrgico (Figura 1). El equipo (Tabla 1) fue esterilizado 48 h antes …

Discussion

Este método describe lúcidamente los detalles necesarios para desarrollar un modelo de osteotomía de fractura en ratas albinas Wistar. Este modelo se puede utilizar para evaluar el efecto osteogénico de un fármaco osteoanabólico prometedor en la curación de fracturas, así como para comprender las complejidades de la curación ósea. La característica más destacada de este método es que es simple y no necesita demasiado tiempo o equipo sofisticado. En este método, se seleccionaron ratas albinas Wistar macho ad…

Materials

Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2