Burada, Wistar albino sıçanlarının femurunun şaftını iyatrojenik olarak kırmak ve nasır gelişimini takip etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu femur osteotomi modeli, araştırmacıların kırık iyileşme sürecini değerlendirmelerine ve bir ilacın kırık iyileşmesini nasıl etkileyebileceğini incelemelerine yardımcı olabilir.
Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir. Osteoanabolik ilaçlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak yüksek maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Amacımız, araştırmacıların femur şaftının kırılmasını takiben nasır oluşumunun gelişimini anlamalarına yardımcı olabilecek ve potansiyel bir ilacın kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek bir femur osteotomi kemirgen modeli geliştirmekti. Yetişkin erkek Wistar albino sıçanları, Kurumsal Hayvan Etik Kurulu izninden sonra kullanıldı. Kemirgenler anestezi altına alındı ve aseptik koşullar altında, açık osteotomi kullanılarak femurların şaftlarının ortada üçte birinde tam enine kırıklar oluşturuldu. Kırıklar intramedüller K-teller kullanılarak azaltıldı ve internal olarak sabitlendi ve sekonder kırık iyileşmesinin gerçekleşmesine izin verildi. Ameliyattan sonra 5 gün boyunca intraperitoneal analjezikler ve antibiyotikler verildi. Sıralı haftalık röntgenler nasır oluşumunu değerlendirdi. Sıçanlar radyolojik olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarına göre kurban edildi ve kırık nasır gelişimi radyolojik olarak ve immünohistokimya kullanılarak analiz edildi.
Kemik, kemik oluşturan hücrelerden, osteoblastlardan ve kemik emici hücrelerden, osteoklastlardan oluşan yoğun bir bağ dokusudur. Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir1. Kırık olduğunda, kırık bölgesinde osteoblastik ve osteoklastik aktivite kemik iyileşmesini belirleyen önemli faktörlerden bazılarıdır2. Kırık iyileşmesi normal seyrinden saptığında, gecikmiş bir birleşme, malunion veya birleşmeme ile sonuçlanır. 9 ay boyunca kırığın birleşme başarısızlığı olduğunda, son 3 ay içinde onarımın ilerlemesi olmadan bir kırığın birleşmediği söylenir3. Tüm kırıkların yaklaşık %10-15’inde nonunion 4’e kadar ilerleyebilecek bir onarım gecikmesiyaşanır. Tüm kırıklarda birleşmeme oranı %5-%10’dur ve tutulan kemiğe ve kırık bölgesine bağlı olarak değişir5.
Kırık kaynamamasının tedavisinde mevcut rejim cerrahi ve/veya tıbbi modaliteleri içermektedir. Şu anda, gecikmiş veya kırıkların birleşmemesi, kemik grefti gibi cerrahi stratejilerle aşılabilir. Bununla birlikte, kemik greftlemenin greft dokusunun mevcudiyeti, donör bölge ağrısı, morbidite ve enfeksiyon gibi sınırlamaları ve komplikasyonları vardır6. Tıbbi tedavi, kemik morfogenetik proteini (BMP) ve teriparatid (parathormon analogu) gibi osteoanabolik ilaçları içerir. Şu anda kullanılan osteoanabolik ajanlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak fahiş maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir7. Bu nedenle, kemik iyileşmesi için uygun maliyetli, cerrahi olmayan alternatifleri belirleme kapsamı vardır. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Kemik iyileşmesini arttırdığı bilinen bir ilaç in vitro olarak değerlendirilmeli ve umut verici bulunursa in vivo hayvan modeli çalışmaları için kullanılabilir. İlaç in vivo modelde kemik oluşumunu ve yeniden şekillenmesini teşvik ettiğini kanıtlarsa, bir sonraki aşamaya (yani klinik çalışmalara) geçebilir.
Hayvanlarda kırık iyileşmesini değerlendirmek, insan denemelerinden geçmeden önce kemik iyileşmesi için tanıtılan yeni bir ajanı değerlendirmek için ileriye doğru atılmış mantıklı bir adımdır. Kırık iyileşmesi ile ilgili in vivo hayvan modeli çalışmaları için, kemirgenler giderek daha popüler bir model haline gelmiştir8. Kemirgen modelleri, düşük işletme maliyetleri, sınırlı alan ihtiyacı ve kemik iyileşmesi için daha az zaman harcanması nedeniyle artan ilgi yaratmıştır9. Ek olarak, kemirgenler, kemik iyileşmesi ve yenilenmesinin moleküler mekanizmaları üzerine çalışmalara izin veren geniş bir antikor ve gen hedefleri spektrumuna sahiptir10. Bir fikir birliği toplantısı, çeşitli küçük hayvan kemik iyileştirme modellerini kapsamlı bir şekilde vurguladı ve kemik iyileşmesini etkileyen farklı parametrelere odaklandı, ayrıca birkaç küçük hayvan kırığı modeli ve implantı vurguladı11.
Temel kırılma modelleri genel olarak açık veya kapalı modellere ayrılabilir. Kapalı kırık modelleri, kemik üzerinde üç veya dört noktalı bir bükme kuvveti kullanır ve geleneksel bir cerrahi yaklaşım gerektirmez. İnsanlarda uzun kemik kırıklarına benzeyen eğik veya spiral kırıklara yol açarlar, ancak kırık yerinin ve boyutlarının standardizasyonunun olmaması bunlarda kafa karıştırıcı bir faktör olarak hareket edebilir12. Açık kırık modelleri, kemiğin osteotomisi için cerrahi erişim gerektirir, kırık bölgesinde daha tutarlı bir kırık paterni elde edilmesine yardımcı olur, ancak kapalı modellere kıyasla gecikmiş iyileşme ile ilişkilidir13. Kırık iyileşmesini incelemek için kullanılan kemik seçimi, boyutları ve erişilebilirlikleri nedeniyle esas olarak tibia ve femur olarak kalır. Kırık yerinin seçimi genellikle diyafiz veya metafizdir. Metafiz bölgesi, osteoporotik deneklerde kırık iyileşmesinin çalışıldığı durumlarda özel olarak seçilir, çünkü metafiz osteoporozdan daha fazla etkilenir14. İntramedüller pimler ve eksternal fiksatörler gibi çeşitli implantlar kırık 11,15’i stabilize etmek için kullanılabilir.
Bu çalışmanın amacı, araştırmacıların sadece femur kırığını takiben nasır gelişimini anlamalarına yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda potansiyel bir ilacın hareket ettiği mekanizmayı anlayarak kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek basit ve takip edilmesi kolay bir kemirgen modeli geliştirmekti.
Bu yöntem, Wistar albino sıçanlarında kırık osteotomi modeli geliştirmek için gereken ayrıntıları açıkça açıklamaktadır. Bu model, umut verici bir osteoanabolik ilacın kırık iyileşmesindeki osteojenik etkisini değerlendirmek ve kemik iyileşmesinin inceliklerini anlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin göze çarpan özelliği, basit olması ve çok fazla zamana veya sofistike ekipmana ihtiyaç duymamasıdır. Bu yöntemde, deneyler için kemirgen modeli olarak yetişkin erkek Wistar albino sıç…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, araştırma finansmanı için Hindistan Hükümeti AYUSH Bakanlığı, Homeopati Araştırmaları Merkez Konseyi’ne (CCRH) teşekkür eder. Yazarlar, Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi’nin hayvan deneylerine olan yardımları ve destekleri için ve CMET, AIIMS, Yeni Delhi’nin fotoğraf ve videografideki yardım ve destekleri için teşekkür eder.
Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |